BioAssay Systems 亮氨酸氨肽酶测定试剂盒-使用96孔板的操作步骤

亮氨酸氨基肽酶（LAP）（E.C 3.4.11.1）是一种在肝细胞和肠细胞中常见的酶，能够从蛋白质和多肽的N-末端水解亮氨酸。LAP的表达在损伤和免疫反应中会增加，因此血清样本中LAP活性的增加可能表明潜在的肝损伤、肿瘤发生或炎症。

BioAssay Systems的LAP活性测定试剂盒提供了一种便捷的比色法，用于测定生物样本中的LAP活性。在此测定中，LAP水解一种与染料结合的亮氨酸底物，产生一种可在405nm处测量的黄色产物。20分钟内405nm处吸光度的增加（?OD）与LAP活性成正比。

作为BioAssay Systems在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐BioAssay Systems热销产品亮氨酸氨肽酶测定试剂盒。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

主要特点：

- 灵敏且准确。 最少可使用10 uL样本。96孔板的线性检测范围为0.025至250 U/L。

- 快速且便捷。 操作过程仅涉及加入单一工作试剂并孵育20分钟。测定可在室温或37°C下进行。

- 高通量。 均质“混合-孵育-测量”型测定。可轻松自动化，每天可测定数千个样本。

应用领域：

- 定量测定生物样本（例如细胞、组织和血清样本）中的LAP酶活性。

- 高通量筛选LAP抑制剂并评估药物调节剂。

试剂盒组成（96孔板100次测试）：

- 测定缓冲液：20 mL

- 底物：100 uL

- 标准品：50 uL

储存条件：试剂盒在室温下运输。收到后将所有组分储存于-20°C。保质期：收货后6个月。

注意事项：试剂仅供研究使用。使用试剂时应遵循实验室试剂的常规注意事项。请参阅材料安全数据表以获取详细信息。

操作步骤：

样本准备：

- 组织：在匀浆前，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗组织以去除血液。将组织（50 mg）在含有50 mM磷酸钾（pH 7.5）的缓冲液中匀浆。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液用于测定。

- 细胞裂解液：通过在4°C下以2,000 x g离心5分钟收集细胞。对于贴壁细胞，不要使用蛋白酶来收获细胞，而是使用橡胶刮刀。在含有50 mM磷酸钾（pH 7.5）的冷缓冲液中适当体积中匀浆或超声处理细胞。在4°C下以14,000 x g离心10分钟。取上清液用于测定。

- 对于未知样本，建议测试几种稀释度以确定最佳样本稀释因子n。

使用96孔板的操作步骤：

1. 标准品。将10 uL提供的100 mM标准品与240 uL去离子水混合，制备250 uL 4 mM预混液。按照表格描述在0.5-mL离心管中稀释标准品。将10 uL标准品分别加入到96孔透明平底板的单独孔中。未使用的标准品可以冷冻保存以供日后使用。

- 向标准品孔中加入190 uL测定缓冲液。

2. 将每个样本的10 uL分别转移到单独的孔中。

3. 制备足够所有样本孔的工作试剂（WR）。对于每个孔，混合1 uL底物溶液和195 uL测定缓冲液。建议现配现用。

4. 向每个样本孔中加入190 uL WR。轻轻但彻底地轻敲板以混匀。

5. 立即在0分钟和20分钟时读取405nm处的吸光度。

所需材料（未提供）：

- LAP酶（例如Sigma，货号L6007）、移液装置及配件（例如多通道移液器）、96孔透明平底板（例如VWR货号82050-760）、离心管和酶标仪。

示例：

使用96孔方案对生物样本进行了三次分析。HEPG2的LAP活性为2.50±0.37 U/L，MDAMB-231为2.18±0.71 U/L，HeLa细胞裂解液为1.33±0.40 U/L。在血清中，LAP牛血清中的活性为0.61±0.09 U/L，人血清中的为1.28±0.12 U/L大鼠血清中为2.09±0.93U/L。

96孔板测定中的标准曲线

文献：

1. Grembecka J, Kafarski P. (2001). Leucine aminopeptidase as a target for inhibitor design. Mini Rev Med Chem; 1(2):133-44.

2. Hitzerd SM, Verbrugge SE, Ossenkoppele G, Jansen G, Peters GJ.(2014). Positioning of aminopeptidase inhibitors in next generation cancer therapy. Amino Acids; 46(4): 793-808.

3. Sato, Y. (2003). Aminopeptidases and angiogenesis. Endothelium;10(6): 287-90. 

BioAssay Systems是一家位于美国北加州湾区的高新技术生物技术公司，专注于研发、生产和销售高品质的生化检测试剂盒，产品种类齐全，主要用于科学研究和生物医药开发，以满足生命科学行业日益增长的需求。BioAssay Systems在现代药物发现领域拥有超过50年的丰富经验，已经开发了超过250种用于药物发现和生命科学研究的检测试剂盒。产品主要包括：1.血液尿液化学；2.酶活性测定；3.能量代谢；4.氧化应激；5.高通量HTS试剂；6.阴阳离子检测。

作为BioAssay Systems在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的BioAssay Systems产品。