胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)是一种消化性丝氨酸蛋白酶,能够在许多真核和原核生物中水解膳食蛋白质。胰蛋白酶主要在赖氨酸和精氨酸氨基酸的羧基侧切割肽链,但不会在脯氨酸之前切割。BioAssay Systems的QuantiFluo?胰蛋白酶抑制剂检测试剂盒使用一种荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的合成底物。荧光素标记的荧光信号被高度猝灭。当样本中的胰蛋白酶消化底物时,底物被切割成更小的肽段,从而消除了荧光猝灭。通过在λex/em = 485/530 nm处测量FITC标记片段的荧光或荧光偏振(FP),抑制作用通过荧光强度的降低来确定。
作为BioAssay Systems在中国的区域总代理,艾美捷科技强烈推荐BioAssay Systems热销产品胰蛋白酶抑制剂检测试剂盒。产品仅用于科研,不可用于临床诊断。
产品名称 | 货号 | 详情 |
胰蛋白酶抑制剂检测试剂盒 | BAS-DTRI-100 | 查看 |
胰蛋白酶抑制剂检测试剂盒:
主要特点:
- 安全。非放射性检测方法。
- 均质且便捷。均质的“混合-孵育-测量”类型检测,无需洗涤和试剂转移步骤。
- 稳健且高通量。可轻松自动化,每天检测数千个样本。检测稳健,Z'因子大于0.7。
应用范围:
用于评估药物和筛选潜在的胰蛋白酶抑制剂。
试剂盒组成(96孔板检测100次):
- 检测缓冲液:10 mL
- 底物:100 ?L
储存条件:
试剂盒在室温下运输。收货后将所有组分储存于-20°C。有效期:收货后6个月。
注意事项:
试剂仅供研究使用。使用试剂时应遵循实验室试剂的常规预防措施。详细信息请参阅材料安全数据表。
操作步骤:
在检测前,将所有组分平衡至室温。本检测基于动力学反应。为确保孵育时间一致,向样本中加入工作试剂时应迅速,混合应简短但充分。建议使用多通道移液器。检测可在室温下进行。注意:本试剂盒不包含酶或抑制剂。客户需自行提供所需的酶或抑制剂。
样本准备:
为防止自身消化,纯胰蛋白酶溶液可在酸性条件下(1 mM HCl,pH 3.0)长期保存于-80°C。在检测缓冲液中稀释纯化的胰蛋白酶。胰蛋白酶应置于冰上,并尽快使用。将测试化合物溶解于合适的溶剂中(例如DMSO)。建议首先测试所选酶对溶剂的耐受性。对于猪胰蛋白酶,检测中DMSO的最终浓度应小于2%。
96孔板中的抑制剂筛选:
1. 将30 ?L胰蛋白酶分别转移至黑色平底96孔板的各个孔中。同时,分别准备30 ?L胰蛋白酶(“对照”)和30 ?L检测缓冲液(“空白”)的孔。
2. 向对照和空白孔中加入10 ?L测试化合物溶解的缓冲液。例如,如果测试化合物溶解于含有0.1% DMSO的缓冲液中,则向这些孔中加入10 ?L该溶液。
3. 向其余含有酶的孔中加入10 ?L测试化合物。轻拍平板以混合均匀,并在室温下孵育15分钟,使抑制剂阻断酶的活性。
4. 通过将每个孔的1 ?L底物和99 ?L检测缓冲液混合,为所有孔准备好工作试剂。向所有孔中加入80 ?L工作试剂。轻拍平板以混合均匀。在室温下避光孵育30分钟,使用酶标仪在λex/em = 485/530 nm处读取荧光或荧光偏振(FP)。
所需材料(但未提供):
- 纯化的胰蛋白酶(例如Sigma Aldrich,产品编号T8003),以及如果需要,胰蛋白酶抑制剂对照品(例如大豆胰蛋白酶抑制剂,Cayman Chemical,产品编号14502;苯甲磺酰氟(PMSF),Sigma Aldrich,产品编号P7626)。
- 移液装置及配件(例如多通道移液器)、黑色平底96孔板(例如Corning Costar)、离心管,以及能够读取λex/em = 485/530 nm处荧光或荧光偏振的酶标仪。
左图:胰蛋白酶与不同浓度的大豆胰蛋白酶抑制剂孵育,生成荧光IC50曲线。
右图:为荧光偏振(FP)测量生成了第二条IC50曲线。
文献参考:
1. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., & Przybylski, M. (2007). Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysylproline containing oligotuftsin peptides. Journal of Peptide Science. 13(4):227–236.
2. López-Otín, C., Bond, J. S. (2008). Proteases: multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry, 283(45): 30433–30437.
3. Shah, D., Mital, K. (2018). The Role of Trypsin: Chymotrypsin in Tissue Repair. Advances in Therapy, 35(1): 31–42.
BioAssay Systems是一家位于美国北加州湾区的高新技术生物技术公司,专注于研发、生产和销售高品质的生化检测试剂盒,产品种类齐全,主要用于科学研究和生物医药开发,以满足生命科学行业日益增长的需求。BioAssay Systems在现代药物发现领域拥有超过50年的丰富经验,已经开发了超过250种用于药物发现和生命科学研究的检测试剂盒。产品主要包括:1.血液尿液化学;2.酶活性测定;3.能量代谢;4.氧化应激;5.高通量HTS试剂;6.阴阳离子检测。
作为BioAssay Systems在中国区域的代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的BioAssay Systems产品。
微信扫码在线客服