液体活检NIPT解决方案

液体活检：癌症早筛 & 无创产前检测（NIPT）解决方案：用于癌症早筛和无创产前检测（NIPT）的完整工作流程解决方案

简介

一、完整的血浆/血清无细胞工作流程

    1、cf-DNA /cf-RNA收集与保存管

        a. 从血浆/血清中纯化cf-RNA

        b. 从血浆/血清中纯化cf-DNA

    2、cf-DNA /c f-RNA研究的实验室指南

    3、血浆Small RNA测序，推荐工作流程

    4、无创产前检测NIPT，开放平台工作流程

    5、权威客户案例

二、完整的尿液无细胞工作流程

    1、尿液收集和保存设备（管，杯，桶)

        a. 从尿液中提取cf-RNA

        b. 从尿液中提取cf-DNA

    2、推荐的小RNA测序工作流程

三、文章与出版物

一、简介：

Norgen Biotek 提供完整的液体活检工作流程，包括样本采集和保存设备、cf-DNA/cf-RNA/exosomes纯化、小RNA/RNA序列和高级生物信息学分析。

我们的样本保存技术，特别针对血浆、尿液和唾液，在保存时间、样本完整性、运输和存储以及多分析物保存方面具有许多优势。

与基于硅胶的技术不同，Norgen的专有碳化硅核酸纯化技术被优化为从不同类型的液体活检中捕获极低量的游离核酸，而不会对游离核酸的序列大小表现出任何偏向性。

利用我们先进的生物信息学分析工具和能力，特别是在Illumina平台上的测序领域，Norgen已经处理了来自顶级研究机构的非常具有挑战性的样本。

液体活检，作为癌症检测的样本类型

01、非侵入性样本采集

02、适用于检测所有癌症类型

03、提供全面的异质性疾病分析

04、提供分子驱动因素的见解

05、允许动态的疾病监测,以监控发展中的肿瘤异质性

1、血清/血浆样本收集&保存

    CF-DNA/CF - RNA PRESERVATIVE TUBES

    cf-DNA/cf-RNA 保存管 (CAT. 63950, D x 639 50)

• CE-IVD 标志符合欧盟指令 98/79/EC 

• 非常适合用于IVD体外诊断工作流程 

• 在单管中同时保存cf-DNA和cf-RNA

• 不含固定剂的防腐剂，无DNA交联 

• 在室温下保存cf-DNA/ct-DNA，30天；37°C下亦可保存8天 

• 在室温下保存cf-RNA ，30天 

• 在室温下将循环肿瘤细胞 （CTC） 保存 14 天 

• 运输/运输后无血浆容量损失 

• 防止溶血，从而更好地分离血浆

• 防止血细胞凋亡和基因组DNA片段化 

• 生产高质量/数量的血浆cf-DNA/ct-DNA/cf-RNA 

• 用真空方式在10 mL的试管中抽取8.4 mL的血液

无细胞的循环DNA和RNA采集与保存 （全血样本）

Figure 1. 环境温度存储对cf-DNA（pDNA）的影响，以短Alu（115bp）片 段为例，以及对基因组DNA（gDNA）的影响，以大Alu（247 bp）片段 为例。

将血样分别放入：1）EDTA管，2）竞争者管或 3）Norgen的cf-DNA / cf-RNA保存管中，并在室温下储存。在稳定期间，代表pDNA的ALU基因（115 bp）和代表gDNA的ALU基因（247 bp）的水平应保持不变，表 明适当稳定和无溶血。在EDTA管中收集并在室温下存储的血浆中未观察到 cf-DNA的稳定和广泛的溶血。竞争者显示在14天后没有显着的稳定性，而 Norgen的cf-DNA / cf-RNA保存管中的cf-DNA在室温下稳定30天。

产品信息：

cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes		用于体外诊断用途 CE-IVD 标志 符合欧盟指令 98/79/EC
50 Tubes	Cat. Dx63950
50 Tubes	Cat. 63950

a. cf-RNA 提取纯化

PLASMA / SERUM CFC-RNA ADVANCED PURIFICATION KIT 

血浆/ 血清 cf-RNA 高级纯化试剂盒(CAT. 68200)

• 可靠的血浆/血清输入范围从1 ml到6 ml 

• 无苯酚提取 

• 无载体RNA 

• 无偏见地结合和洗脱所有RNA，无论大小或GC含量 

• 将循环RNA和外泌体RNA浓缩到25 uL至50 uL，灵活控制洗脱体 

• 积仅需45min，即得高质量的RNA 

• 在Hamilton MicroLab Nimbus上进行全自动纯化程序 

• 纯化的RNA适用于各种下游应用，包括小RNA测序 

• 纯化基于旋转柱色谱法，使用Norgen的专有树脂分离基质

分离提取，所有大小的循环和外泌体RNA，包括microRNA

Figure 1. 使用不同的cfc-RNA纯化方法从K2EDTA血浆中纯化的RNA中 扩增miR-21和miR-16的rt-qPCR。

与使用Q品牌的纯化试剂盒（于二氧化硅的技术）纯化的RNA中扩增相 同的miRNA目标相比，Norgens专利的SiC技术，不论是手动提取和自动 设备提取都更有优势。

产品信息：

PLASMA / SERUM CIRCULATING AND EXOSOMAL RNA 

PURIFICATION KITS (SLURRY FORMAT) 

血浆/血清循环和外泌体 RNA纯化试剂盒 （浆液形式，适合大体积样本与DIY）

 (CAT . 42800 , Dx428 00, 51000 , 5 0900, 29500，满足不同上样量)

• CE-IVD 标志，符合欧盟委员会法规 （EU） 第 2017/746 号 （Dx42800） 

• 分离所有大小的循环和外泌体RNA，包括microRNA 

• 适用于多种血浆和血清样本输入体积（0.25 mL至5 mL） 

• 将循环和外泌体RNA浓缩成较小的洗脱体积 

• 分离循环和外泌体RNA，不含抑制剂 

• 无偏见地结合和洗脱所有大小或GC含量的RNA 

• 提供旋转柱或96孔板格式 

• 使用真空或离心法处理96孔板 

• 纯化的RNA适用于多种下游应用，包括小RNA测序

• 与Streck无细胞RNA BCT管兼容 

• 纯化基于使用Norgen专有树脂分离基质的旋转柱层析法

从血浆/血清样品中快速简单地分离循环RNA，包括外泌体RNA

Figure 1. 分离和检测不同血浆容积的循环RNA。

使用Norgen的血浆/血清循环RNA纯化和外泌体RNA分离小试剂盒（浆 料格式）从0.5 mL、1 mL和2 mL血浆中分离循环RNA。然后，将纯化后 的RNA的3 ?L用作RT-qPCR反应的模板，以检测人类5S基因。 

从所有使用的血浆样品体积中检测到5S基因。 5S rRNA的扩增显示随着 样品输入量的增加，RNA的数量也增加。这通过随着样品输入量的增加 而降低Ct值来表示。从0.5 mL血浆中分离的RNA用红线表示，从1 mL血 浆中分离的RNA用绿线表示，而从2 mL血浆中分离的RNA用蓝线表示。 黑线对应于无模板对照。

Plasma/Serum Circulating and Exosomal  RNA Purification Kits (Slurry Format)
50 Preps (Mini)	Cat. 51000
50 Preps	Cat. 42800
50 Preps	Cat. Dx42800
25 Preps(Maxi)	Cat. 50900
1 x 96-Well Plate	Cat. 29500

cf-RNA 提取纯化

PLASMA /SERUM RNA PURIFICATION KITS 

血浆/血清 RNA 纯化试剂盒 (CAT. 55000, 56100, 56200)

• 分离所有大小的循环和外泌体RNA，包括microRNA 

• 适用于多种血浆和血清样本输入体积：50 ul to 200 ul 

• 无酚提取 

• 无载体RNA 

• 无偏见地结合和洗脱所有大小或GC含量的RNA 

• 将循环和外泌体RNA浓缩成较小的洗脱体积：10 ?L to 100 ?L 

• 在15-20分钟内纯化高质量的RNA 

• 纯化后的RNA适用于各种下游应用，包括小RNA测序 

• 与Streck无细胞RNA BCT?管兼容 

• 纯化基于Norgen专有的树脂分离基质的旋转柱层析法

从血浆/血清样品中快速简单地纯化循环RNA和外泌体RNA

Figure 1. 在检测人类5S转录本和miR-21时，确定血浆RNA样品中存在的 抑制量。

使用Norgen的Plasma/Serum RNA纯化最大试剂盒（Cat. 56200）从 1.5 mL、3 mL和5 mL血浆中提取DNA。将洗脱物的增加体积（2、4和8 ?L）用于20 ?L逆转录反应，然后进行qPCR扩增反应，观察Ct值的降低 情况。模板数量增加时Ct值的增加将清楚地表明样品中存在PCR抑制 剂。

在逆转录反应中使用的PCR输入体积的增加不会影响qPCR扩增得到的 Ct值，无论是对于（A）5S rRNA转录本还是（B）miR-21。实际上，Ct 值随着PCR输入体积的增加而减小，这表明使用Norgen的试剂盒从血 浆中纯化的RNA不含常见的抑制剂。

产品信息：

PLASMA/SERUM EXOSOME PURIFICATION AND RNA ISOLATION KITS 

血浆/ 血清外泌体纯化及RNA提取试剂盒 (CA T. 58300, 58500, 58600)

• 完整血浆/血清外泌体的纯化和富集，用于功能研究 

• 无论大小或GC含量，都能分离所有大小的RNA，包括microRNA， 没有偏见 

• 满足多种样本输入体积需求 

• 无酚提取 

• 无需蛋白酶K处理或载体RNA 

• 无需耗时的超速离心、过滤或特殊注射器 

• 无需沉淀试剂或过夜孵育，适用于任何物种的血浆/血清 

• 纯外泌体经过纯化，不含任何其他RNA结合蛋白 

• 纯化基于Norgen专有的树脂分离基质的旋转柱层析

从血浆和血清样本中纯化外泌体，并提取外泌体中RNA

Figure 1. 从不同的血浆中纯化外泌体，并提取外泌体中RNA。

Norgen的血浆/血清外泌体纯化和RNA分离迷你试剂盒（Cat# 58300）被用来从不同血浆体积的外泌体中分离出RNA，使用同 一试剂盒。然后用2 uL分离的RNA作为RT-qPCR反应的模板，评估分离的血浆外泌体miR-26a的扩增情况。(A）血浆外泌体 miR-26a随着样品输入量的增加呈线性下降。(B）血浆外泌体 miR-26a的相对量显示出良好的线性，回收率超过90%。

产品信息

b.cf-DNA 提取纯化

PLASMA/SERUM CFC- DNA ADVANCED PURIFICATION KIT

血浆/血清 CFC-DNA高级纯化试剂盒(CAT. 68000 )

• 可灵活处理0.5 mL至6 mL的血浆和血清输入量 

• 将cfc-DNA和ct-DNA浓缩至可变洗脱体积（25 ?L至50 ?L） 

• 在纯化的cfc-DNA中最小化gDNA污染 

• 提取的细胞外循环DNA，无抑制剂残留 

• 仅需45min，即可提取优质的DNA 

• 适用于从Norgen的cf-DNA/cf-RNA保护管（Cat. 63950，Dx63950）、 Cell-Free DNA BCT?（Streck）、肝素、EDTA或柠檬酸采集的新鲜、保存或冷冻血清/血浆 

• 在Hamilton自动化平台上进行完全自动化的分离过程 

• 纯化基于使用Norgen专有树脂分离的旋转柱色谱法

从血浆和血清样品中快速简单地纯化各种大小的 CFC-DNA 和 CT-DNA

Figure 1. Norgens 血浆/血清 cfc-DNA 高级纯化试剂盒用于从 1 mL、2 mL、4 mL 和 6 mL 血浆中纯化循环 DNA，这些血浆由 EDTA 上收集的血液作为抗凝剂制备而成。 

然后将2 uL纯化的DNA用作qPCR反应的模板，通过靶向代表单核小体 CFC-DNA群体的短ALU基因靶标（115 bp）来评估纯化的cfc-DNA的 线性。Norgen的血浆/血清cfc-DNA高级纯化试剂盒在所有血浆体积之 间显示出出色的线性，线性百分比超过90%，表明从所有使用的血浆 体积中高效回收cfc-DNA。

产品信息：

PLASMA /SERUM CIRCULATING DNA PURIF I C A TION KITS ( SLURRY FORMAT)

血浆/血清循环DNA纯化试剂盒（浆液形式，适合大体积样本与DIY） (CA T. 5060 0, 5 1200, 513 00)

• 从血浆和血清样本中分离所有大小的循环DNA 

• 可提取病毒和细菌DNA 

• 适用于多种血浆和血清输入体积（50 ?L - 10 mL） 

• 将循环DNA浓缩到小的洗脱体积 

• 根据下游应用选择不同的洗脱策略 

• 分离无抑制剂的循环DNA，适用于包括PCR、qPCR、甲基化敏感PCR在内的任何应用 

• 与Streck无细胞DNA BCT?管兼容 

• 可从牛奶中高质量和高数量地分离DNA 

• 纯化基于旋转柱层析，使用Norgen的专有树脂分离基质

从血浆/血清样品中快速简单地分离循环DNA

Figure 1. 从0.5 mL和2 mL血浆中检测人类5S基因。

将Norgen的血浆/血清循环DNA纯化Midi试剂盒（浆料格式）与Q 品牌试剂盒进行比较，以评估其分离高质量血浆DNA的能力，以供 敏感的下游应用，如qPCR。当处理0.5 mL和2 mL血浆时，Norgen 样品（蓝色）的扩增速度比竞争对手Q的样品（红色）更快，表明 Norgen样品中存在更多高质量循环DNA的回收率更高。

产品信息:

cf-DNA 提取纯化

PLASMA/SERUM CELL-FREE CIRCULATING DNA PURIFICATION KITS 

血浆/ 血清无细胞循环DNA纯化试剂盒 (CAT. 55500, D x 55500, 55100, D x 55100, 55600, D x 55600, 55800, D x 55800)

• 可分离病毒和细菌DNA 

• 满足不同血浆和血清输入体积（10 uL - 10 ml） 

• 将循环 DNA 浓缩至可变洗脱体积（25 uL - 50 uL） 

• 分离的无细胞循环DNA，不含抑制剂 

• 15-20分钟内纯化高质量的DNA 

• 与Streck Cell-Free DNA BCT? 管兼容 

• 纯化基于使用Norgen专有树脂分离基质的离心柱色谱

从血浆和血清样品中快速简单地纯化各种大小的循环DNA

Figure 1. 从采用柠檬酸盐作为抗凝剂采集的50 uL、100 uL和200 uL血浆中纯化游离DNA，并与Q公司的试剂盒进行比较。

取2 uL纯化的DNA作为模板，在qPCR反应中评估纯化的常规5S rRNA基因的相对数量。随着样品输入量的增加，5S rRNA基因的相 对数量呈线性增加。与其他分离方法相比，Norgen的试剂盒显示出 对常规5S rRNA基因的最一致和最高的回收率。

产品信息：

Plasma/Serum Cell-Free Circulating DNA Purification Kits
50 Preps (Micro)	Cat. 55500
50 Preps (Micro)	Cat. Dx55500
50 Preps (Mini)	Cat. 55100
50 Preps (Mini)	Cat. Dx55100
20 Preps (Midi)	Cat. 55600
20 Preps (Midi)	Cat. Dx55600
10 Preps (Maxi)	Cat. 55800
10 Preps (Maxi)	Cat. Dx55800

2、cf-DNA/cf-RNA 研究的实验室指南

介绍 

无细胞研究提供了一种简单、全面且非侵入性的诊断和研究方法。通过采集一个快速的血液样本，研究人员可以诊断 癌症，揭示未出生婴儿的特征，或者识别患者的许多遗传异常。传统方法如活检是痛苦且侵入性的，并且很有可能对 患者进行错误诊断或造成更大的伤害。为了帮助您在cf-DNA / cf-RNA研究中获得最大收益，本电子书提供了实验台指 南，以确保准确的结果。从使用我们的cf-DNA / cf-RNA保存管进行采集和运输到核酸的纯化，甚至包括测量和测序等 下游应用，Norgen为您的工作流程的每一步提供全面的解决方案。

样本采集和保存 

由于血浆样本中cf-DNA和cf-RNA（统称为无细胞核酸或cf-NA）的浓度较低（1-100 pg/μL），建议首先确定所需的血 液体积。为了收集样本，最好使用无需依赖EDTA或肝素的血液收集管（BCT），因为这两种管子都无法在超过18小时 的时间内保持样本，并且可能会干扰下游应用。此外，如果以室温（RT）运输，在EDTA或肝素管中收集的血液将开始 溶血，从而不适合进行cf-NA研究。如果没有保护管，应在收集后不超过1小时离心回收血浆，并在发货前将其储存 在-70°C的干冰上。如果使用了cf保存管，则不需要考虑这一点。

根据所使用的保护管，血样可以在RT条件下储存7天至30 天，而不会出现有害水平的溶血。对于EDTA或肝素管来 说，即使储存不到一天，都会开始出现溶血。图1显示了在 Norgen的cf-DNA / cf-RNA保藏管中收集的血液中溶血的水 平与EDTA和另一种商业可得到的血液收集管的比较。与 EDTA相比，Norgen管在30天内保持的血浆中血红蛋白（溶血的指标）水平较低，EDTA在几天收集后开始显示明显的 溶血。排名第二的竞争对手在14天后开始显示溶血。

Figure 1. Norgen的cf-DNA/cf-RNA防腐管、竞争对手的试管和 EDTA单管之间的血红素吸收率比较。血红素是血细胞裂解的一个很好的指标，因为它在细胞死亡时被释放出来，并具有独特的吸光度曲线。

样本定量和质量确定 

NanoDrop? 仪器不适用于评估血浆中cf-DNA和cf-RNA的质量和数量，因为其检测阈值为5 ng/μL，比血浆中cf-NA浓 度高出50到5000倍。使用Bioanalyzer确定的RNA完整性数值（RIN）也被排除作为质量确定的手段，因为它依赖于细 胞RNA，具体是18S和28S rRNA。如果样本经过适当的处理和准备，这两个标记物都不应存在。如果存在这些标记 物，则样本已被污染，很可能是与溶血产物有关，因此可能对cf-NA测试无效。

幸运的是，针对低核酸含量和cf-NA特异性提取和定量，存在适用的试剂盒和方法。Norgen提供低丰度DNA和RNA定 量试剂盒，灵敏度可达到1 pg/μL范围，甚至更低。下面的图2显示了不同已知DNA数量的qPCR图表，证明了这一点。 只需在适当荧光核酸染料的辅助下，这些试剂盒可以与任何qPCR系统一起使用。

可使用改良的Quant-iTTM RiboGreen? RNA检测试剂盒来定量cfRNA，而类似地改良的Quant-iTTM PicoGreen? dsDNA试剂盒可 定量cf-DNA。请参阅附录以了解协议的修改内容。 Agilent生产的高灵敏度DNA试剂盒可以检测低至5 pg/μL的DNA， 而他们的RNA 6000 Pico Kit 结合Bioanalyzer（图3）使用时，可以 检测到50 pg/μL的RNA。 Bioanalyzer示踪图还可以提供视觉定性 信息。纯样品只会在140-180 bp附近有一个峰，而含有gDNA污染 的样品则在较高bp范围内有第二个宽峰，如图4所示。

Figure 2. 使用Norgen的低丰度DNA定量试剂盒生成的代表性qPCR基线图。扩增可观察到500 fg范围。

Figure 3. Bioanalyzer示踪图显示cf-RNA的高捕获率（约18个荧光单 位）（A，Norgen血浆/血清cfc-RNA高级纯化试剂盒），以及cfRNA捕获率较低的RNA示踪图（约4个荧光单位）（B，竞争对手Q 循环核酸检测试剂盒）。

Figure 4. Bioanalyzer示踪图显示从Norgen的cf-DNA/cf-RNA保管管 中获得的纯cf-DNA（蓝色），经Norgen cf-DNA分离试剂盒纯化，以 及从商用血液采集管中获得的含有gDNA污染的示踪图（红色）。污 染示踪图中cf-DNA的增加是由于细胞溶解时释放的核小体。由于它们 相对稳定，它们是最常见的降解DNA形式之一。

样品的纯度也可以通过观察Ct值/PCR输入图表的线性来确定 （图5）。随着PCR输入的增加，可能干扰反应的化合物浓度也 会增加。Ct值和PCR输入之间的强烈负相关，且无或最小偏离线 性，表明PCR抑制剂的浓度较低。抑制剂可能由于溶血而进入样 品，这如前所述可能使样品失效。

Figure 5. 高纯度核酸样品的代表性Ct值/PCR输入图

附录 

 对于cf-NA定量，建议修改Quant-iTTM RiboGreen? RNA检测试剂盒和Quant-iTTM PicoGreen? dsDNA检测试剂盒的方 法是将反应缩放至20 μL，并在0.5 mL光学透明管中进行。其次，不要使用推荐的浓缩DMSO库存的200倍稀释（在TE 中），而是改为1000倍稀释。提供的NA标准应按以下说明准备：

 1) 对于浓度范围从1 ng/μL到100 pg/μL：

将提供的100 μg/mL RNA标准的2 μL稀释至最终体积为100 μL，用无核酸酶水稀 释至最终浓度为2 μg/mL。这将用于准备标准。

2) 对于50 pg/μL到5 pg/μL的浓度：

将2 μg/mL溶液的5 μL与95 μL核酸酶自由水稀释，获得最终RNA浓度为100 ng/mL，然后准备以下标准溶液。当然，这也适 用于DNA标准。反应混合物由1μL样品、9 μL 1X TE和10μL RiboGreen?或PicoGreen?试剂组成。

3、血浆Small RNA-seq工作流程：

1、收集与保存 

cf-DNA/cf-RNA Preservative Tube，cf-DNA/c f-RNA 保存管 (Cat. Dx69350, 69350) 

• 在室温下保存 cf-RNA、cf-DNA 和 ct-DNA 长达30天 

• 防止运输过程中的溶血 

• 血浆回收率高 

• 不含固定剂的防腐剂，无DNA交联 

• 与市售的cf-RNA和cf-DNA纯化方法兼容 

• 提供带有CE-IVD认证的产品版本

2 、RNA 提取纯化

Plasma/Serum RNA Puri?cation Kit ，血浆/血清 RNA 纯化试剂盒 (Cat. 55000, 56100, 56200) 

• 利用Norgen专有的树脂基质来纯化RNA 

• 分离所有与蛋白质结合的循环cf-RNA，包括细胞外囊泡的RNA 

• 结合并洗脱所有的RNA，无论其大小或GC含量如何，都不会有偏差 

• 不使用载体RNA 

• 不使用苯酚或氯仿等危险化学品 

• 可处理50 uL至5 mL的血浆 

• 纯化的RNA与下游应用兼容，如qPCR、NGS、微阵列等。

Plasma/Serum Exosome Puri?cation and RNA Isolation Kit 

 血浆/ 血清外泌体纯化及 RNA 提取试剂盒 (Cat. 58300, 58500, 58600)

• 利用Norgen的专利树脂基质，先纯化外泌体，再纯化RNA。 

• 结合并洗脱所有的RNA，无论其大小或GC含量如何，都不会有偏差 

• 不使用载体RNA 

• 不使用苯酚或氯仿等危险化学品 

• 可处理50 μL至10 mL的血浆 

• 纯化的RNA与下游应用兼容，如qPCR、NGS、微阵列等。

3 . NGS服务 (SMALL RNA 测序) 

Library Preparation: Small RNA Library Prep Kit 

文库制备： 小RNA文库制备试剂盒 (Cat. 63600) 

• 针对超低输入的RNA进行了优化，尤其是来自体液的RNA 

• 多达48个indices 的可用性 

• 快速和简单的工作流程 

测序 

• Illumina 平台 

生物信息分析 

• 使用生物信息学分析了解转录后调控机制 

• 研究基因差异表达并发现新的生物标志物 

• 完整的报告和随时可发表的图文数据

4、无创产前检测NIPT，开放平台工作流程

1. 收集与保存 

cf-DNA/cf-RNA Preservative Tube，cf-DNA/c f-RNA 保存管 (Cat. Dx69350, 69350)

• 在室温下保存 cf-RNA、cf-DNA 和 ct-DNA 长达 30 天 

• 防止运输过程中的溶血 

• 血浆回收率高 

• 不含固定剂的防腐剂，无DNA交联 

• 与市售的cf-RNA和cf-DNA纯化方法兼容 

• 提供带有CE-IVD认证的产品版本

References 

a. Ward Gahlawat A, Lenhardt J, Witte T, et al. Evaluation of storage tubes for combined analysis of circulating nucleic acids in liquid biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20(3):704. doi:10.3390/ijms20030704 

b. Maass KK, Schad PS, Finster AM, et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 2021;13(12):3002. doi:10.3390/cancers13123002

2 . DNA提取纯化 

Plasma/Serum Cell-Free Circulating DNA Puri?cation Kits 血浆/血清无细胞循环DNA纯化试剂盒(Cat. 55500, 55100, 55600 and 55900) 

• 利用Norgen公司专有的树脂基质纯化细胞外循环DNA 

• 分离所有蛋白结合的循环cf-DNA 

• 无论大小或GC含量如何，都能捕获和洗脱所有DNA，没有偏差 

• 不使用苯酚或氯仿等危险化学品 

• 可以处理10μL到10 mL的血浆 

• 将DNA洗脱到25-50 μL的洗脱体积 

• 纯化的DNA与qPCR、NGS等下游应用兼容

3 、文库制备 

Norgen不提供DNA的文库制 备试剂盒，但是，我们的RNA纯化和DNA分离试剂盒与任何用于全基 因组测序的商业文库制备试剂盒兼容

4 .测序和数据分析 

有了准备好的DNA，可以进行全 基因组测序来观察整个胎儿基因组，以确定是否有任何遗传异常。 其他有针对性的方法包括SNP分析和微阵列

5、客户成功案例： 

Alex Rolland: 使用外泌体 ct-DNA 改善癌症诊断

我的名字是Alex Rolland，我是Cancer Treatment Options and Management Inc.（CTOAM）和Liquid Biopsy Labs的联合创始人和首 席科学家。 

在我们寻找从血液中提取ct-DNA的试剂盒时，我是第一次听说Norgen Biotek，时间大概在2018年末/2019年初。我们当时测试了非常多的试剂 盒并查看了评论，但都未能获得足够的ct-DNA量，无法在TaqmanddPCR平台上获得结果。Norgen的试剂盒基于离心技术，易于提取，并 且初始微型试剂盒使我们能够获得珍贵的可测试的ct-DNA，因此我被 Norgen强烈吸引！ 

 Norgen是唯一给我们带来期望结果的公司。此外，我们一直在使用一种来自大公司的ct-DNA保存管，它允许我们从两 个管中获得2-4 mL的血浆/血清。然而，这些管子存在问题，Norgen的一位高级研究科学家建议我尝试Norgen的管 子。再次，结果令人惊讶，我们能够从2个管子中获得多达7-10 mL的血浆/血清。这显著提高了我们的产量，并使我们 能够进行下一阶段的推进。

总结一下我们在Norgen产品中发现的优势: 

• 从血管获得高产量的血浆/血清 

• 从他们的提取试剂盒中获得高产量的癌症/胚 泡相关的ct-DNA

Alex Rolland 在研究中使用的Norgen产品

案例研究

案例1

 一名结肠癌患者在其肿瘤DNA测序中发现了PRKDC（肿瘤抑 制基因）的一个未定变异体（VUS）。我们进行了一个基于 计算机的分析/序列保守性分析，结果显示这个变异体很可 能是致病的。事实证明，我们随后使用它来检测此患者的早 期复发情况，并评估治疗效果。

Figure 1. 从患者全血中获取的PRKDC A358T外泌体DNA量。误差线表示95%置信区间（CI）

案例2 

该患者患有晚期乳腺癌，我们的测序结果显示其PIK3CA基 因发生了突变。当时，用于治疗特定类型乳腺癌的药物 Alpelisib在加拿大尚未获得批准，因此我们联系了药品制造 商并说服他们提供免费的药物，同时从加拿大卫生部获得 了同情使用权，并使用ct-DNA监测患者的治疗反应。不幸 的是，在这种情况下，患者只能短暂地耐受药物，并不得 不停止使用。正如您所看到的，我们的测试显示了未经有 益治疗的ct-DNA增加。

Figure 2. 从患者全血中获取的PIK3CA P1047L外泌体DNA量。误差线表示95%置信区间（CI）

真实的科学家，真实的故事，真实的成功！

一、尿液收集&保存

URINE COLLECTION AND PRESERVATION TUBES 

尿液收集与保存管 (CAT . 18116 , 18120, 18111, 18129)

• RNA/microRNA/DNA/蛋白质，可以在室温下保存超过2年 

• 与大多数DNA、总RNA、microRNA和蛋白质分离方法兼容 

• 保存剂以单剂量液态格式（安瓿）提供 

• 保存剂也以干燥格式在管中提供 - 尿液收集和保存管 

• 尿液收集和保存管有4种方便的尺寸：5 cc管、15 cc管、50 cc管和 120 cc杯

简单且快速地保存尿液样本

Figure 1. Norgen的尿液保存剂中RNA的稳定性

从多个健康捐赠者收集尿液样本并混合，然后将尿液分装到 Norgen的尿液收集和保存管（5cc）（Cat.18116）中，保存在-20° C、4°C和室温下长达24个月。然后使用Norgen的尿液总RNA纯化 Maxi Kit（浆料格式）（Cat.29600）从保存的尿液中在时间0、1个 月、2个月、4个月、8个月、12个月、16个月和24个月后随后分离 尿液RNA。

产品信息：

a. cf-RNA 提取纯化

URINE CELL-FREE CIRCULATING RNA PURIFICATION KITS 

尿液无细胞循环RNA纯化试剂盒(CAT. 56900, 57000, 57100)

• 250 μL 至 30 mL ，满足多种尿液上样量 

• 无苯酚萃取 

• 无载体RNA 

• 结合并洗脱所有RNA，无论大小或GC含量如何，无偏差 

• 将循环 RNA 和外泌体 RNA 浓缩成 50 μL 至 100 μL 的灵活洗脱体积 

• 25 - 30 min 提取纯化高质量 RNA 

• 纯化的RNA适用于各种下游应用，包括Small RNA测序 

• 纯化基于使用Norgen专有树脂分离基质的离心柱色谱

分离所有大小的循环和外泌体RNA，包括microRNA

Figure 1. 从不同尿液体积中纯化无细胞循环RNA和外泌体RNA。 

使用Norgen的尿液无细胞循环RNA纯化小试剂盒（目录号56900） 从0.5 mL、1 mL和2 mL尿液样本中纯化无细胞循环和外泌体RNA。 然后，将纯化的RNA中取2微升作为RT-qPCR反应的模板，以评估 （A）常规的5S rRNA转录本和（B）miR-21的扩增情况。无论是 （A）5S rRNA转录本还是（B）miR-21的平均Ct值都随着样本输入 量的增加而线性减少。

产品信息：

URINE EXOSOME PURIFICATION AND RNA I SOL ATION KITS 

尿液外泌体纯化和RNA分离试剂盒 (CAT. 58400, 58700, 58800)

a. 无论大小或GC含量，都可以结合和洗脱所有RNA，没有偏差 

b. 分离各种大小的外泌体RNA，包括microRNA 

c. 可变的尿液输入量（250 ?L至30 mL） 

d. 不需要苯酚萃取，蛋白酶K处理或载体RNA 

e. 不需要耗时的超速离心，过滤或特殊注射器 

f. 不需要沉淀试剂或过夜孵育 

g. 与任何物种的尿液兼容 

h. 纯外泌体被纯化并且不含任何其他RNA结合蛋白

i. 纯化基于使用Norgen专有树脂分离基质的旋转柱层析

完整尿液外泌体的纯化和富集，满足功能研究需求

Figure 1. 从不同尿量中纯化的外泌体中分离RNA。 

使用Norgen的尿液外泌体纯化和RNA分离试剂盒（Cat. 58800）使用相同的试剂盒从不同尿量中纯化外泌体，并分 离RNA。随后，使用分离的RNA的2微升作为RT-qPCR反应 中的模板，评估分离的尿外泌体miR-30a的扩增情况。（A） 随着样品输入量的增加，尿外泌体miR-30a呈线性下降趋 势。B）尿外泌体miR-30a的相对量显示出良好的线性关系， 回收率超过90％。

产品信息：

b. cf-DNA 提取纯化

URINE CELL-FREE CIRCULATING DNA PURIFICATION KITS 

 尿液无细胞循环DNA纯化试剂盒(CAT. 56600, 56700, 56800)

分离病毒DNA 

适用于不同体积的尿液输入（250 ?L - 30 mL） 

将循环DNA浓缩到灵活的洗脱体积范围内（50 ?L - 100 ?L） 

分离的细胞外循环DNA，无抑制剂 15-20min，即得高质量DNA 

与Norgen的尿液保存剂和其他市售尿液保存剂兼容 

纯化基于使用Norgen专有的树脂分离基质的旋转柱色谱法。

从新鲜、保存或冷冻的尿液样本，分离出所有大小的循环DNA

Figure 1. 在检测人类5S基因时，确定尿液细胞游离DNA样本中的抑 制量。

使用Norgen的尿液细胞游离DNA纯化Maxi试剂盒（型号56800）， 从10 mL、20 mL和30 mL尿液中分离DNA。在20 ?L的qPCR反应中 使用不同体积的洗脱物（2、4和8 ?L），观察Ct值是否有减小。随 着模板量的增加，Ct值的增加将明确表明样本中存在PCR抑制剂。 在qPCR中使用不同洗脱物体积作为模板并不影响由qPCR生成的Ct 值。事实上，Ct值倾向于随着PCR输入体积的增加而减小，表明使 用Norgen试剂盒纯化的尿液中的DNA不含通常存在于尿液中的常见 抑制剂。

2、尿液 Small RNA- Seq 工作流程

1、 收集与保存 

Urine Collection and Preservation Devices - 5cc, 15cc, 50cc, 120cc, single dose， 

• 尿液收集与保存管 (Cat. 18118, 18122, 18113, 18126, 18129) 

• 提供多种尺寸的用户友好型尿液收集装置 

• RNA/microRNA/DNA/蛋白质可以在室温下保存超过2年 

• 兼容商业化的cf-RNA纯化方法 

• 在运输尿液时，可以在常温下保存游离大分子、剥落细胞和微生物

2、RNA提取纯化 

Urine Cell-Free Circulating RNA Puri?cation Kit，

尿液无细胞循环RNA纯化试剂盒 (Cat. 56900, 57000, 57100) 

• 利用Norgen的专有树脂基质纯化细胞外循环RNA 

• 分离所有蛋白结合的循环cf-RNA，包括细胞外囊泡的RNA 

• 无论大小或GC含量，都能结合和洗脱所有RNA，没有偏见 

• 不使用载体RNA 

• 不使用危险化学品，如苯酚或氯仿 

• 可以处理250 ?L到30 mL的尿液 

• 纯化的RNA与下游应用（如qPCR、NGS、微阵列等）兼容。

Urine Exosome Puri?cation and RNA Isolation Kit， 

尿液外泌体纯化和RNA分离试剂盒 (Cat. 58400, 58700, 58800)

3 . NGS服务 (SMALL RNA 测序) Library Preparation: Small RNA Library Prep Kit 

文库制备： 小RNA文库制备试剂盒 (Cat. 63600) 

• 针对超低输入的RNA进行了优化，尤其是来自体液的RNA 

• 多达48个indices 的可用性 

• 快速和简单的工作流程

测序 

• Illumina 平台

生物信息分析

• 通过生物信息学分析来理解转录后调控 

• 检查差异表达并发现新的生物标志物 

• 完整的报告和随时可发表的图文数据

三、文章 / PUBLICATIONS

1. From Sampling To Sequencing: A Liquid Biopsy Pre-Analytic Workflow To Maximize Multi-Layer Genomic Information From A Single Tube https://www.mdpi.com/2072- 6694/13/12/3002 

2 . Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies https://www. mdpi.com/1422-0067/20/3/704 

3 . Comprehensive evaluation of methods to isolate, quantify, and characterize circulating cell-free DNA from small volumes of plasma https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8846-4 

4 . Effect of microRNA GC Content on RNA Purification Efficiency (App Note made by Norgen) https://norgenbiotek. com/sites/default/files/resources/plasma_serum_circulating_ and_exosomal_rna_purification_kit_slurry_format_effect_of_ microrna_gc_content_on_rna_purification_efficiency_application_notes_465_0.pdf 

5 . Comparison of Four Commercial Kits for Isolation of Urinary Cell-Free DNA and Sample Storage Conditions https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7236016/ 6 . Measurement Biases Distort Cell-Free DNA Fragmentation Profiles and Define the Sensitivity of Metagenomic Cell-Free DNA Sequencing Assays https://academic.oup.com/clinchem/ article/68/1/163/6410769?login=false