精氨酸酶(L-精氨酸脲水解酶,EC 3.5.3.1)存在于哺乳动物和植物中。 在人类中,精氨酸酶主要在肝脏中表达,也在乳腺、肾脏、睾丸、唾液腺、表皮和红细胞中少量表达。精氨酸酶催化精氨酸转化为鸟氨酸和尿素,完成尿素循环的最后一步。精氨酸酶活性是一个关键的诊断指标。血液中精氨酸酶活性的增加与肝损伤有关。由于精氨酸酶缺乏引起的高精氨酸血症是一种常染色体隐性遗传疾病。
在研究和药物发现中,用于测量生物样本中精氨酸酶活性的简单、直接且易于自动化的检测方法非常受欢迎。 BioAssay Systems的精氨酸酶检测试剂盒提供了一种灵敏且便捷的精氨酸酶活性测定方法。该方法利用一种显色剂,该显色剂仅与精氨酸酶反应中产生的尿素特异性结合形成有色复合物。颜色的强度与样本中的精氨酸酶活性成正比。
作为BioAssay Systems在中国的区域总代理,艾美捷科技强烈推荐BioAssay Systems热销产品精氨酸酶测定试剂盒(100T)。产品仅用于科研,不可用于临床诊断。
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精氨酸酶测定试剂盒(100T) | BAS-DARG-100 | 查看 |
主要特点
- 灵敏且准确。检测限:在96孔板检测格式中,2小时精氨酸酶反应的检测限为0.3 U/L。
- 简单且高通量。该程序涉及将提供的底物与样本在微孔板中共孵育,然后加入显色试剂。可以轻松自动化,每天可检测数千个样本。
应用
- 直接检测:酶制剂、血清、血浆、细胞培养等中的精氨酸酶活性;
- 药物发现/药理学:药物对精氨酸酶活性的影响。
试剂盒组成
- 精氨酸缓冲液(pH 9.5):1.5 mL
- 锰溶液:300 ?L
- 试剂A:12 mL
- 试剂B:12 mL
- 尿素标准品(50 mg/dL):0.5 mL
储存条件
- 试剂盒在室温下运输。将精氨酸缓冲液和尿素标准品存于-20°C,其他组分存于2-8°C。
- 保质期:收到后12个月。
注意事项
- 试剂仅供研究使用。使用试剂时应遵循实验室试剂的常规预防措施。请参阅材料安全数据表以获取详细信息。
样本准备
- 血清和血浆样本含有尿素。可以使用膜过滤器(例如Millipore的Amicon Ultra-0.5,Ultracel-10膜,10 kDa)通过以下程序耗尽尿素:
1. 将最多100 ?L样本装入Amicon Ultra-0.5(10 kDa截止)中,并用水稀释至500 ?L。以14,000 rpm离心30分钟,检查样本液面,理想情况下样本液面应少于50 ?L。加水至500 ?L并重复离心。
2. 将浓缩的样本稀释液倾倒出来,并用移液管测量最终体积。调整最终体积,以便有足够的样本用于反应和反应空白。
- 细胞裂解液:每份样本收获约10?个细胞,并用PBS洗涤。在4°C下以1,000g离心10分钟。在100 ?L 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)中裂解细胞团块,其中含有1 ?M pepstatin A、1 ?M leupeptin和0.4%(w/v)Triton X-100。在4°C下以14,000g离心裂解液10分钟。使用上清液进行精氨酸酶检测。
检测程序
- 在检测前将所有试剂平衡至室温。精氨酸缓冲液应预热至37°C。重要提示:在制备后2小时内使用复溶试剂。
1. 尿素标准品。通过将24 ?L 50 mg/dL尿素和176 ?L水混合制备1 mM尿素标准品。将50 ?L 1 mM尿素标准品和50 ?L去离子水分别加入96孔板的不同孔中。
2. 精氨酸酶反应:将4体积的精氨酸缓冲液和1体积的锰溶液混合制备5×底物缓冲液。每个测试需要10 ?L 5×底物缓冲液。接下来,将每个样本的40 ?L分别加入96孔板的两个不同孔中。向其中一个样本孔中加入10 ?L 5×底物缓冲液(ODSAMPLE)。另一个样本孔不加5×底物缓冲液(样本空白对照,ODBLANK)。在37°C下孵育反应板2小时或所需反应时间。
- 注意:根据精氨酸酶活性,样本可能需要用去离子水稀释。尽管检测在2小时精氨酸酶反应中线性范围为0.3-20 U/L,但如果样本稀释后表观活性在1-10 U/L之间,检测效果最佳。
3. 尿素测定:将等体积的试剂A和试剂B混合制备尿素试剂。向所有孔中加入200 ?L尿素试剂(注意:尿素试剂会终止精氨酸酶反应),然后向样本空白对照孔中加入10 ?L 5×底物缓冲液。轻拍板以混合。在室温下孵育60分钟,并在430 nm处读取吸光度。
- 注意:对于某些样本,加入尿素试剂可能会导致浑浊。如果发生这种情况,请将样本转移到Eppendorf管中,并以14,000 rpm离心5分钟。将上清液转移回反应板,并读取吸光度。
计算
其中,ODSAMPLE、ODBLANK、ODSTANDARD和ODWATER分别是样本、样本空白、标准品和水的吸光度值。[尿素标准品] = 1 mM,t为反应时间(120分钟)。50和40分别是反应和样本体积(?L)。
- 精氨酸酶反应的孵育时间可以根据精氨酸酶活性变化(0.5至4小时)。如果(ODSAMPLE – ODBLANK)/(ODSTANDARD – ODWATER)大于2,则可以将样本稀释于去离子水中,重复检测,并将结果乘以稀释因子,或者使用更短的精氨酸酶反应时间。
- 单位定义:1单位精氨酸酶在pH 9.5和37°C下,每分钟将1 ?mol L-精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。
文献参考:
1. Moertel, L. et al. (2008) Comparative real-time PCR and enzyme analysis of selected gender-associated molecules in Schistosoma japonicum. Parasitology 135, 575–583.
2. Pulichino, A.M. et al. (2008) Identification of Transforming Growth Factor β1–Driven Genetic Programs of Acute Lung Fibrosis. Am. J. Respiratory Cell & Mol. Biol. 39: 324-336.
3. Ndolo, E.A. et al. (2010) The Role of Lysosomes in Limiting Drug Toxicity in Mice. J Pharmacol Exp Ther. 333:120-128.
BioAssay Systems是一家位于美国北加州湾区的高新技术生物技术公司,专注于研发、生产和销售高品质的生化检测试剂盒,产品种类齐全,主要用于科学研究和生物医药开发,以满足生命科学行业日益增长的需求。BioAssay Systems在现代药物发现领域拥有超过50年的丰富经验,已经开发了超过250种用于药物发现和生命科学研究的检测试剂盒。产品主要包括:1.血液尿液化学;2.酶活性测定;3.能量代谢;4.氧化应激;5.高通量HTS试剂;6.阴阳离子检测。
作为BioAssay Systems在中国区域的代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的BioAssay Systems产品。
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