BioAssay Systems 丙酮酸脱氢酶测定试剂盒-高灵敏度和宽线性范围

丙酮酸脱氢酶（PDH）（E.C. 1.2.4.1）是一种氧化还原酶，催化丙酮酸的脱羧反应，生成乙酰化二氢硫辛酰胺，该反应依赖于硫胺素焦磷酸（TPP）。PDH是PDH复合体的E1组分，最终生成乙酰辅酶A。PDH复合体连接了糖酵解和柠檬酸循环。这种非放射性比色法PDH测定基于苯嗪甲磺酸（PMS）偶联反应中四氮唑盐MTT的还原，生成的还原型MTT在565nm处有最大吸收峰。生成的紫色强度与PDH活性成正比。

作为BioAssay Systems在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐BioAssay Systems热销产品丙酮酸脱氢酶测定试剂盒。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

主要特点：

-高灵敏度和宽线性范围。检测限为0.87 U/L，在96孔板测定中线性范围可达至少278 U/L PDH。

-均质且简单的操作程序。简单的“混合-测量”程序可在20分钟内可靠定量PDH活性。

-稳定且适用于高通量筛选（HTS）。所有试剂均与高通量液体处理仪器兼容。

应用领域：

-直接测定：生物样本中的PDH活性。

-药物发现：PDH调节剂的筛选和评估。

试剂盒组成（96孔板100次测试）：

-测定缓冲液：8.0 mL

-TPP溶液：500 uL

-PMS溶液：500 uL

-丙酮酸：500 uL

-MTT溶液：1.0 mL

-校准液：1.0 mL

储存条件：试剂盒在室温下运输。收到后将所有组分储存于-20°C。保质期：收货后6个月。

注意事项：试剂仅供研究使用。使用试剂时应遵循实验室试剂的常规注意事项。请参阅安全数据表以获取详细信息。

操作步骤：

本测定基于动力学反应。为确保孵育时间一致，加入工作试剂到样本中的操作应迅速，混合应简短但彻底。建议使用多通道移液器。测定可在室温（25°C）或37°C下进行。

样本准备：

-本测定使用从猪心脏中获得的纯化PDH（Sigma P7032）进行优化。对于未知样本，建议用户尝试不同稀释度的酶制剂以获得最佳结果。

-组织：在解剖前，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗组织以去除血液。将组织在每克组织5 mL含有100 mM磷酸钾（pH 7.0）和1 mM EDTA的缓冲液中匀浆。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液用于测定。

-细胞裂解液：通过在4°C下以2,000 x g离心5分钟收集细胞。对于贴壁细胞，不要使用蛋白酶来收获细胞，而是使用橡胶刮刀。在含有100 mM磷酸钾（pH 7.0）和1 mM EDTA的冷缓冲液中适当体积中匀浆或超声处理细胞。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液用于测定。

-所有样本可以在-20至-80°C下保存至少一个月。

试剂准备：将试剂平衡至所需的反应温度（例如25°C或37°C）。使用前短暂离心试剂管。

测定步骤：

1.将100 uL H?O（ODH?O）和100 uL校准液（ODCAL）溶液分别加入到96孔透明平底板的单独孔中。

2.将每个样本的20 uL分别加入到单独的孔中，并将20 uL测定或样本缓冲液加入到单独的孔中，作为“无酶”空白。

   -为所有样本孔（包括“无酶”空白孔）准备足够量的工作试剂（WR）。对于每个孔，混合：10 uL MTT溶液、5 uL PMS溶液、5 uL TPP溶液、5 uL丙酮酸底物和60 uL测定缓冲液。需要现配现用。工作试剂应在使用前新鲜制备，并避光保存。

   -向每个样本孔和“无酶”空白孔中加入80 uL新鲜WR。轻轻敲击板以混匀。

3.立即在565nm处读取吸光度（ODS0），并在20分钟后再次读取（ODS20）。（孵育期间应保护板免受光照。）

所需材料（未提供）：

-移液装置及配件（例如多通道移液器）、96孔透明平底板（例如VWR货号82050-760）或比色皿，以及能够测量565nm吸光度的酶标仪或分光光度计。

实例：

在96孔板测定中对猪心脏PDH活性进行滴定。

文献：

1. Gray, LR et al (2014) Regulation of pyruvate metabolism and human disease. Cell. Mol. Life. Sci. 71:2577-2604.

2. Ke, C-J et al (2014). A new spectrophotometric assay for measuring pyruvate dehydrogenase complex activity: a comparative evaluation.Anal. Methods. 6:6381-6388.

3. Sun, W et al (2015) The role of Pyruvate Dehydrogenase Complex in cardiovascular diseases. Life Sci. 121:97-103. 

BioAssay Systems是一家位于美国北加州湾区的高新技术生物技术公司，专注于研发、生产和销售高品质的生化检测试剂盒，产品种类齐全，主要用于科学研究和生物医药开发，以满足生命科学行业日益增长的需求。BioAssay Systems在现代药物发现领域拥有超过50年的丰富经验，已经开发了超过250种用于药物发现和生命科学研究的检测试剂盒。产品主要包括：1.血液尿液化学；2.酶活性测定；3.能量代谢；4.氧化应激；5.高通量HTS试剂；6.阴阳离子检测。

作为BioAssay Systems在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的BioAssay Systems产品。