BioAssay Systems 半胱天冬酶-3检测试剂盒检测步骤&注意事项

半胱天冬酶（Caspases）是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族的成员，在细胞凋亡中发挥核心作用。凋亡参与多种生理和病理事件，从正常的胎儿发育到癌症、器官衰竭和神经退行性疾病等疾病。半胱天冬酶-3（Caspase-3）是评估凋亡和理解凋亡诱导机制的关键生物标志物。

BioAssay Systems的Caspase-3检测试剂盒为测定生物样本中的Caspase-3活性提供了一种便捷的方法。在检测中，特异性底物（N-Ac-DEVD-AFC）被活化的Caspase-3切割，形成一种高荧光产物。荧光强度（激发/发射波长=400/490 nm）与Caspase-3活性成正比。

作为BioAssay Systems在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐BioAssay Systems热销产品半胱天冬酶-3检测试剂盒。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

主要特点  

- 安全。非放射性检测。  

- 便捷且高通量。均相“混合-孵育-测量”型检测法。可在高通量筛选液体处理系统上轻松自动化，每天可处理数千个样本。

应用  

- 测定细胞和组织裂解液中的Caspase-3活性。  

- 高通量筛选凋亡诱导剂和抑制剂。

试剂盒内容  

- 检测缓冲液：12 mL  

- 底物：240 ?L  

- DTT溶液：240 ?L  

储存条件  

本产品在室温下运输。收到后，将所有试剂储存于-20°C。保质期：收货后12个月。

注意事项  

试剂仅供研究使用。使用试剂时应遵循实验室试剂的常规安全措施。请参考材料安全数据表以获取详细信息。

96孔板检测步骤  

注意：以下步骤适用于96孔板的标准检测。如果细胞不是在96孔板中培养的，需要单独制备细胞裂解液（参见“一般注意事项”）。建议对照组和样本组均进行重复检测。

1. 细胞培养：将100 ?L浓度为1,000 - 100,000个细胞的细胞悬液接种到无菌黑色透明底96孔板的孔中（注意：使用的细胞数量取决于细胞系）。在细胞培养箱中于37°C孵育过夜。

2. 细胞处理：加入10 ?L测试化合物（例如凋亡诱导剂或抑制剂），使其达到所需浓度，并加入10 ?L溶剂（溶解测试化合物的培养基）作为对照。  孵育细胞一段时间。

3. Caspase-3检测：检测前，将所有试剂平衡至室温。短时间离心试剂管。为所有检测孔准备足够量的工作试剂。对于每个孔，将100 ?L检测缓冲液、2 ?L底物和2 ?L DTT混合。  

- 去除检测孔中的培养基。对于贴壁细胞，直接从孔中吸出培养基；对于悬浮细胞，以500 x g离心5分钟，小心吸出培养基。  

- 立即向每个检测孔中加入100 ?L工作试剂。通过在微孔板振荡器上以100 - 200 rpm的转速振荡60秒，使试剂完全混合。工作试剂可裂解细胞并支持最佳的Caspase-3活性。  

- 在37°C下避光孵育微孔板60分钟。

4. 读取荧光强度：在激发/发射波长=400/490 nm处读取荧光强度。  

注意：如果Caspase-3活性较低，可以增加孵育时间，或使用更多细胞。

计算  

从对照孔的荧光强度值中减去样本孔的荧光强度值。ΔF值表示相对的Caspase-3活性。

一般注意事项  

- 对于未在96孔板中培养的细胞，需要单独制备细胞裂解液，并用于Caspase检测。  

- 在细胞经过测试化合物处理一段时间后，去除培养基。对于贴壁细胞，直接吸出培养基；对于悬浮细胞，以500 x g离心5分钟并吸出培养基。  

- 向每10?个细胞加入300 ?L裂解液（50 mM Hepes，pH 7.2；100 mM NaCl；0.5%（体积比）Triton X-100）裂解细胞。  

- 在4°C下振荡细胞悬浮液30分钟。  

- 在4°C下以2,500 x g离心细胞悬浮液10分钟。  

- 将上清液转移至干净的试管中。如果当天不进行检测，裂解液可在-80°C下保存一个月。  

- 检测时，将50 ?L样本裂解液加入黑色96孔板的不同孔中。立即向每个检测孔中加入100 ?L工作试剂。在37°C下避光孵育微孔板60分钟。在激发/发射波长=400/490 nm处读取荧光强度。

标准曲线

左图：在RBL-2H3和PANC-1细胞系中，staurosporine诱导Caspase-3活性的时间过程。  

右图：在RBL-2H3（EC?? = 14.2 nM）和PANC-1（EC?? = 13.9 nM）细胞系中，staurosporine诱导Caspase-3活性。

文学：

1. Hug H et al (1999). Rhodamine 110-linked amino acids and peptides as substrates to measure caspase activity upon apoptosis induction in intact cells. Biochemistry 38:13906-11.

2. Jones J, et al (2000). Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. J Biomol Screen. 5:307-18.

3. Wang ZQ, et al (2005). N-DEVD-N'-morpholinecarbonyl-rhodamine 110:novel caspase-3 fluorogenic substrates for cell-based apoptosis assay.Bioorg Med Chem Lett. 15:2335-8.

BioAssay Systems是一家位于美国北加州湾区的高新技术生物技术公司，专注于研发、生产和销售高品质的生化检测试剂盒，产品种类齐全，主要用于科学研究和生物医药开发，以满足生命科学行业日益增长的需求。BioAssay Systems在现代药物发现领域拥有超过50年的丰富经验，已经开发了超过250种用于药物发现和生命科学研究的检测试剂盒。产品主要包括：1.血液尿液化学；2.酶活性测定；3.能量代谢；4.氧化应激；5.高通量HTS试剂；6.阴阳离子检测。

作为BioAssay Systems在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的BioAssay Systems产品。