可能的原因及建议： 

●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条 带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。 

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白 酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。 

●一抗特异性不高重新选择或制备 高特异性的抗体。 

●一抗不纯纯化抗体 

●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

●︶条带呈笑脸状 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。 

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚 合不完全。 

●拖尾原因：样品溶解不好。 

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。 

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样 位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

可能的原因及建议： 

●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。 

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 

●一抗孵育的温度偏高，建议 4℃结合过夜。 

●选择的膜容易产生高背景，一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。 

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。 

●检测时曝光时间过长，减少曝光时间。

小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去 了。

一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉 下来，结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这 样的话，PVDF 膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 

（1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶 55v，分离胶75v 就能跑得很好。 

（2）胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.

均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4 度过夜。

是 Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl：8g，Trisbase：2.42g加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的Tween-20,用HCl 调节 pH至7.4,加水定容至1L。

选用beta-actin 就可以。

一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊 的方法，一般来说都没有区别。

可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上 查查就可以选出你要的内参。

一般来说，是小分子量Marker 跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错 的选择。