我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1 微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜 上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?
你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇。
如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上NaF 去抑制磷酸化酶 的活性。
同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot 检测吗?
当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。
同一样品能同时提 RNA 又提蛋白么?这样对westernblot 有无影响?
能,没有问题。
细胞水平要做 westernblot,多少细胞提的蛋白够做westernblot?
一般5×10^6 就足够了。
做 WesternBlot 时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕 迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个 santacloz 的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑 制剂单加PMSF 行吗?
怀疑是样品问题,可能是:
1,样品不能反复冻融;
2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查WesternBlot 过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制 剂来说,一般加PMSF 就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和westernblot 试验吗?做这两个试验时 的一抗和二抗可以共用吗?
①免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Westernblot 可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫 组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF 等?
NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。
蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?
可能是:
a)样品浓度过低;
b)转移时间不够。
抗原检测出的分子量比资料上的大,是怎么回事?
a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。
b)蛋白本身的修饰 如:糖基化,磷酸化等。
DAB 好还是 ECM 好?
DAB 有毒,但是比较灵敏,是 HRP 最敏感的底物;ECM 结果容易控制,但被催化时灵敏度差一 点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。
我在显影液中显影1 分钟和5 分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.;
b)显影 时间过长。
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