SiR-肌动蛋白试剂盒--立即成像，无需洗涤步骤

SiR-actin 基于硅罗丹明（SiR）荧光团和肌动蛋白结合天然产物雅斯普霉素（jasplakinolide）。SiR-actin 可在活细胞中特异性地标记 F-肌动蛋白，背景低（1）。SiR-actin 的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜技术（STED 和 SIM）兼容。这些特性在一个探针中的独特组合使 SiR-actin 处于卓越的前沿。

艾美捷SiR-肌动蛋白试剂盒（#CY-SC001）物理性质：

- 吸收波长（abs）：652 nm  

- 发射波长（Em）：674 nm  

- 摩尔吸光系数（ε652 nm）：1.0×105 mol-1·cm-1  

- 分子量（MW）：1241.6 g/mol  

- 分子式（MF）：C71H88N8O10Si  

储存与操作

收到后请将化合物保存在 -20°C 以下。使用无水 DMSO 配制化合物溶液。使用后请将溶液保存在 -20°C 以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO 溶液应特别小心处理，因为 DMSO 已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。

注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-actin 基于肌动蛋白稳定药物雅斯普霉素。因此，它可以改变活细胞中的肌动蛋白动态。尽管在高达 3 ?M 的 SiR-actin 浓度下，有丝分裂持续时间保持不变，但在培养的 HeLa 细胞中，超过 100 nM 的浓度会导致细胞增殖指数降低（1）。如果计划进行长期成像实验，且肌动蛋白动态至关重要，我们建议将 SiR-actin 的浓度保持在 100 nM 或以下。对于其他用途，建议使用 1 ?M 的 SiR-actin 进行染色。

配制 1 mM 储备液

将 SiR-actin 小瓶中的内容物溶解在 50 ?L 无水 DMSO 中，制备 1 mM 储备液。此溶液应保存在 -20°C 或以下。不要将溶液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，此储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要精确测定储备液的浓度，将 1 ?L 1 mM 储备液稀释在含有 0.2% SDS 的 99 ?L PBS 中。在室温下静置 15 分钟后，测量 652 nm 处的吸光度。使用上述摩尔吸光系数计算浓度。

配制染色液

将 SiR-actin 稀释到所需的浓度，加入细胞培养基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用 1 ?M 的浓度，以快速获得强染色效果，然后在后续实验中逐步降低 SiR-actin 的浓度，直至达到最佳染色效果（见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，导致 SiR-actin 染色效果不佳。在染色液中加入 10 ?M 的维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常会显著改善染色效果。仅使用新配制的染色液，不要重复使用。

细胞准备与染色

按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于 37°C、含 5% CO? 的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系：

细胞成像： 

SiR-actin 的成像最好使用标准的 Cy5 设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在 100 nM 或以下，以获得稳定的信号并避免探针对肌动蛋白动态产生干扰（细胞增殖减少）。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。

SiR-肌动蛋白试剂盒文献参考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavi?ius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)