RhoA Pulldown活化检测试剂盒，简单测定细胞中RhoA的激活

Rho开关通过在活性的GTP结合态和非活性的GDP结合态之间交替来发挥作用。了解调节GTP酶激活/失活的机制显然具有生物学意义，也是当前研究的热点。许多Rho家族效应蛋白能够特异性识别蛋白质的GTP结合形式，这一特性已被实验性地利用来开发一种强大的亲和纯化测定法，用于监测RhoA蛋白的激活。该测定法使用Rho效应蛋白Rhotekin的Rho结合域（RBD）。RBD基序已被证明能特异性结合RhoA的GTP结合形式。Rhotekin的RBD区域对GTPRhoA具有高亲和力，并且Rhotekin的结合会导致GTP水解的固有速率和催化速率显著降低，这使得它成为从细胞裂解液中亲和纯化GTPRhoA的理想工具。本试剂盒提供的RhotekinRBD蛋白包含Rhotekin的789位残基，以GST融合蛋白的形式存在，这使得人们能够利用颜色鲜艳的谷胱甘肽亲和珠子“拉下”RhotekinRBD/RhoGTP复合物。因此，该测定法提供了一种简单的方法来定量检测细胞中RhoA的激活。通过使用特异性针对RhoA的抗体进行Westernblot来确定激活的RhoA的量。

艾美捷RhoA Pulldown活化检测试剂盒（#BK036S）试剂盒内容：

根据测定设置，该试剂盒包含足够进行20次测定的材料，并包括用于阳性和阴性对照的试剂。还有可供进行80次测定的较大版本试剂盒，货号为BK036。包含以下组分：

#RT02：带有颜色的琼脂糖珠子上的GST标签RhotekinRBD蛋白

#ARH03：RhoA特异性单克隆抗体

#RH01：His标签RhoA蛋白

#BS01：GTPγS（非水解性GTP类似物）

GDP

细胞裂解缓冲液

洗涤缓冲液

上样缓冲液

停止缓冲液

货号PIC02：蛋白酶抑制剂混合液

附有详细操作步骤和广泛的故障排除指南的手册

所需设备

SDSPAGE迷你凝胶系统和Westernblot转移装置

实验结果示例：

图1：试剂盒BK036S中颜色鲜艳的谷胱甘肽琼脂糖珠子使其易于使用。

通过在细胞裂解液中加载RhoA蛋白，分别使用GTPγS或GDP来测试RhoA激活测定法。正如预期的那样，加载了GTPγS的RhoA被非常高效地沉淀，而加载了GDP的RhoA沉淀量很少（见图2）。

图2：使用试剂盒BK036S进行RhoA激活测定的结果。激活的Rho通过Westernblot检测，使用试剂盒BK036S进行沉淀。第一泳道显示50纳克重组His标签RhoA标准品（Rec.HisRhoA）。接下来的泳道显示从等量细胞裂解液中沉淀的非活性、GDP加载的RhoA（RhoAGDPPD）或活性、GTPγS加载的RhoA（RhoAGTPPD）。

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