SiR-DNA试剂盒：细胞准备、染色与成像方案

SiR-DNA基于硅罗丹明（SiR）荧光团和DNA小沟结合剂双苯咪唑（Hoechst）。SiR-DNA可在活细胞中特异性地标记DNA，背景低（1）。SiR-DNA的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜技术（STED和SIM）兼容。这些特性在一个探针中的独特组合使SiR-DNA处于卓越的前沿。

艾美捷SiR-DNA试剂盒（#CY-SC007）物理性质：

-吸收波长（Abs）：652nm

-发射波长（Em）：674nm

-最大摩尔吸光系数（εmax）：1.0×10?mol??·cm??

-分子量（MW）：950.2g/mol

-分子式（MF）：C56H59N9O4Si

储存与操作

收到后请将化合物保存在-20°C以下。使用无水DMSO配制化合物溶液。使用后请将溶液保存在-20°C以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-DNA基于DNA小沟结合分子双苯咪唑。因此，它可以改变活细胞中的DNA代谢。在高达10?M的SiR-DNA浓度下，有丝分裂持续时间和染色体错误分离保持不变。然而，一项独立研究（1）使用CyclinB1和γH2AX报告基因检测建议，如果计划进行长期（>12小时）成像实验，建议使用250nM或以下浓度的SiR-DNA。对于所有其他用途，建议使用1-3?M的SiR-DNA进行染色。

配制1mM储备液：

将SiR-DNA小瓶中的内容物溶解在50?L无水DMSO中，制备1mM储备液。此溶液应保存在-20°C或以下。不要将溶液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，此储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要精确测定储备液的浓度，将1?L1mM储备液稀释在含有0.2%SDS的99?LPBS中。在室温下静置15分钟后，测量652nm处的吸光度。使用上述摩尔吸光系数计算浓度。

配制染色液：

将SiR-DNA稀释到所需的浓度，加入细胞培养基（例如DMEM+10%胎牛血清）中，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用3?M的浓度，以快速获得强染色效果，然后在后续实验中逐步降低SiR-DNA的浓度，直至达到最佳染色效果（见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，导致SiR-DNA染色效果不佳。在染色液中加入1-10?M的维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常会显著改善染色效果。

细胞准备与染色：

按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5%CO?的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系：

注意：SiR-DNA可以对用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞进行染色。

细胞成像：

SiR-DNA的成像最好使用标准的Cy5设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在1?M或以下，以获得稳定的信号并避免探针对DNA代谢产生干扰。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。请注意，SiR-DNA可能会被360-390nm的光激发，并由于探针的DNA结合部分的荧光而在大约450nm处产生一些荧光。

SiR-DNA试剂盒文献参考：

1. Sen, Onur, Adrian T. Saurin, and Jonathan MG Higgins.; Scientific reports 8.1 (2018): 7898