肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏的纯化与使用

心肌肌球蛋白是从牛心组织中纯化的（1, 2）。完整的肌球蛋白包括其必需轻链（ELC）和调节轻链（RLC）被纯化，详见图1和图2。随后，肌球蛋白通过α-胰蛋白酶消化，释放出可溶性的亚片段-1（S1）结构域，并通过离心分离（3）。纯化的肌球蛋白S1片段已在F-肌动蛋白激活的ATP酶活性测定中被证实具有生物学活性（见生物学活性测定）。牛心肌肌球蛋白S1片段以白色冻干粉形式提供。

图1. 肌球蛋白蛋白及其亚片段的示意图

图例：肌球蛋白是一种由两条重链和两条轻链组成的六聚体蛋白。在镁存在的情况下，肌球蛋白可以通过α-胰蛋白酶被蛋白酶解为重链肌球蛋白（HMM）和轻链肌球蛋白（LMM）。然而，在EDTA存在的情况下，α-胰蛋白酶会产生可溶性的肌球蛋白S1片段（3）。

图2. 完整肌球蛋白和S1肌球蛋白

将20微克的完整牛心肌球蛋白（泳道A）和相应的S1肌球蛋白（泳道B）通过4-20% SDS-PAGE凝胶电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。箭头表示肌球蛋白重链（约200 kDa），箭头表示调节轻链（约20 kDa）和两种必需轻链同工型（约25 kDa和21 kDa）。蛋白定量采用Precision Red?蛋白测定试剂（货号：ADV02）进行。Mark12分子量标记来自Invitrogen。

艾美捷肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏（#CS-MYS03）用途：

1. 测量钙激活的肌球蛋白ATP酶活性，当其与细丝结合时。  

2. 识别/表征影响TT复合物调节和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白质或小分子。  

3. 识别/表征影响肌球蛋白/F-肌动蛋白相互作用的蛋白质或小分子。

储存与复溶

短暂离心以使产品聚集在管底。用300微升Milli-Q水复溶1毫克的MYS03（10毫克瓶用3毫升）将产生浓度为3.3毫克/毫升的心肌S1肌球蛋白溶液，其缓冲液组成为：20 mM PIPES，pH 7.0，5%（质量/体积）蔗糖和1%（质量/体积）葡聚糖。该蛋白应避免反复冻融。冻干蛋白在4°C干燥条件下（湿度<10%）可稳定保存1年。

纯度

通过扫描密度法对4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上考马斯亮蓝染色的蛋白进行分析，确定用于产生肌球蛋白S1片段的肌球蛋白及其轻链的纯度为90%（见图2）。

生物学活性测定 ：

牛心肌球蛋白S1片段的生物学活性可通过其F-肌动蛋白激活的ATP水解速率来确定。测定方法是先将肌动蛋白聚合形成F-肌动蛋白，然后将心肌原肌球蛋白/原肌钙蛋白复合物（TT复合物）与肌动蛋白丝按化学计量比混合。这会形成类似肌肉纤维细丝的包被丝。肌球蛋白以亚化学计量比加入，并用ATP和钙启动反应。严格的质量控制确保在缺乏钙的情况下，TT复合物完全抑制肌球蛋白ATP酶活性。加入10微摩尔钙后，肌球蛋白ATP酶活性将恢复。钙与原肌钙蛋白C结合，使其从F-肌动蛋白上解离，从而使肌球蛋白能够结合。

试剂

1. 心肌TT复合物（1×1毫克，货号：TT05）  

2. 心肌肌球蛋白S1（0.25毫克），货号：MYS03）  

3. 心肌肌动蛋白（1毫克，货号：AD99-A）  

4. ATP酶活性生化试剂盒（货号：BK051）  

5. 100 mM ATP，溶于50 mM Tris-HCl，pH 7.5（100微升）  

6. 1 M二硫苏糖醇，溶于水（100微升）  

7. PM12反应缓冲液（12 mM PIPES-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl?）  

8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0

肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏文献参考：

1. Pollard, T.D., . 1982. Methods in Cell Biol. 24:333

2. Margossian, S.S., and Lowey, S. 1982. Methods in Enzymology.85:55-71.

3. Weeds, A.G., and Taylor, R.S. 1975. Nature (London) 257:54.

4. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.