Rho激活剂II--免转染，免过表达，靶向激活内源Rho，更接近生理状态

一、背景介绍

G-Switch? 系列小 G 蛋白工具的开发重点在于创建高效靶向内源性 Rho 家族蛋白及其通路的试剂。与依赖目标蛋白过表达或敲低的方法（如转染显性负性/持续激活型 Rho 突变体、RNAi 敲低）不同，G-Switch? 试剂作用于内源性靶蛋白，起效迅速（数分钟至数小时，视产品而定），从而更有可能产生接近生理状态的响应。该系列产品涵盖直接和间接调控 Rho 家族信号转导的试剂，为研究这些关键细胞功能提供了广泛的机制性工具。

CN03 的活性位点基于细菌细胞毒性坏死因子（CNF）毒素的催化结构域。该催化结构域与专有的细胞穿透模块共价连接。CN03 通过去酰胺化 Rho GTPase 开关 II 区第 63 位谷氨酰胺来激活 Rho GTPase 亚型。该修饰将谷氨酰胺-63 转化为谷氨酸，阻断内源性及 GAP 刺激的 GTPase 活性，导致 Rho 持续激活。CN03 在加入培养基后 2–4 小时内可显著提高 GTP 结合态 RhoA 水平。此外，其靶向作用机制使其在 Rho GTPase 信号研究中比经典间接激活剂（如 LPA，会同时激活 Ras、PI3K 和 PLC 等其他信号通路）更具优势。

二、产品描述

由艾美捷代理Cytoskeleton推出的Rho激活剂II（货号：CN03）应用方向：

在活细胞中快速、特异、不可逆地激活 RhoA、RhoB 和 RhoC 蛋白

直接激活 Rho

作为活细胞中 Rho 激活的阳性对照

研究 Rho 介导事件的机制

材料说明：

CN03 属于 G-Switch 系列，来源于细菌 CNF 毒素催化结构域，并连接专有细胞穿透模块。其通过去酰胺化开关 II 区第 63 位谷氨酰胺直接激活 Rho GTPase，将其转化为谷氨酸并阻断 GTPase 活性，从而实现 Rho 持续激活。CN03 采用细菌表达系统生产，为 118 kDa 的 His 标签重组蛋白，以每管 20 ?g 冻干粉形式提供。

三、制备与使用

以冻干粉形式提供

每管用 200 ul 无菌水复溶，得到 0.1 mg/ml 试剂

推荐工作浓度：1 ug/ml

每管足够配制 20 ml 工作浓度溶液

四、纯度

蛋白纯度通过 4–20% 聚丙烯酰胺凝胶上 Coomassie 蓝染色蛋白的扫描密度测定法评估，纯度大于 80%。

五、生物活性检测

CN03 的生物活性通过其在活 Swiss 3T3 细胞中强力激活 RhoA 的能力来验证。以 1 ug/ml 处理，可在 1–2 小时内实现最佳激活，约十倍激活水平，采用 RhoA G-LISA 试剂盒（BK124）测定。

含单个点突变、使 CN03 催化结构域失活的蛋白在 Rho 激活生物实验中显示零活性。

不同细胞系对 CN03 的响应可能有所不同。

激活时间线：通常 1–4 小时达到激活峰值

激活持续时间：不可逆激活，≥ 4 小时

典型激活倍数：10–15 倍

六、储存与复溶

常温运输。冻干蛋白在 4°C、干燥条件下可稳定保存 6 个月。CN03 冻干粉块可能呈现松散、轻微堆积状态，但不影响产品质量或性能。

复溶时，请短暂离心使产品收集至管底，每管用 200 ul 无菌水重悬，冰上放置 10 分钟后轻柔吹打混匀，得到 0.1 ug/?l 浓度。使用前，CN03 应用无血清生长培养基进一步稀释至 0.25–5 ug/ml（具体浓度由用户确定）。通常，1 ug/ml 浓度可在多种细胞类型中于 3 小时内实现 RhoA 的强力激活。

复溶后的激活剂可液氮速冻，于 -70°C 保存最多 6 个月。

文献参考

1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated byEscherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387,725-729.

2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the Gprotein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387,729-733.