Rho激活剂II：不可逆组成型激活，活细胞阳性对照优选

一、产品概述

CN03 是 G-Switch 系列产品中的核心成员，来源于细菌 CNF 毒素的催化结构域，并通过专有技术连接了细胞穿透性基团。该重组蛋白能够快速、特异、不可逆地激活活细胞中的 RhoA、RhoB 和 RhoC 蛋白，为研究 Rho 介导的细胞事件提供了强大的正向调控工具。

CN03 在细菌表达系统中生产，为带有 His 标签的重组蛋白，分子量约为 118 kDa。每管提供 20 ug 冻干粉。该产品由Cytoskeleton研发，艾美捷代理。

二、核心应用场景

活细胞中 Rho 蛋白的直接激活：无需上游信号分子或激动剂，直接作用于 Rho 蛋白本身。

Rho 激活实验的阳性对照：在进行 RNA 干扰、抑制剂筛选或基因敲除实验时，作为验证通路活性的可靠参照。

研究 Rho 介导事件的潜在机制：探究细胞骨架重塑、细胞迁移、黏附、增殖、分化等过程中 Rho 信号通路的上下游关系。

三、作用机制

CN03 通过催化 Switch II 区域第 63 位谷氨酰胺（Gln-63）的脱酰胺化，将其转化为谷氨酸，从而阻断 Rho GTPases 的内源性 GTP 水解活性。这一修饰导致 Rho 蛋白持续处于 GTP 结合状态，实现组成型激活。与传统的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）不同，CN03 不依赖于核苷酸交换，而是直接破坏 GTP 酶活性中心，因此激活效果为不可逆。

该机制对 RhoA、RhoB 和 RhoC 具有高度选择性，对其他 Rho 家族成员（如 Rac 或 Cdc42）无明显交叉激活作用。

四、产品关键特性汇总

特性 | 描述

分子量 | 118 kDa（含 His 标签）

来源 | 细菌表达系统

纯度 | >80%（考马斯亮蓝染色扫描密度法）

规格 | 20 ug/管，冻干粉

推荐工作浓度 | 1 ug/ml

激活时效 | 1–4 小时达到峰值

激活持续时间 | 不可逆，≥4 小时

典型激活倍数 | 10–15 倍

五、制备与使用方法

重构步骤

1. 每管冻干粉中加入 200 ul 无菌水。

2. 轻轻混匀至完全溶解，得到浓度为 0.1 mg/ml 的储备液。

3. 根据实验需要，用细胞培养基稀释至工作浓度（推荐 1 ug/ml）。

用量计算

每管（20 ug）重构后可得 200 ul 储备液（0.1 mg/ml）。

按 1 ug/ml 工作浓度计算，每管足够配制 20 ml 工作液。

操作建议

将 CN03 直接加入细胞培养基中，无需转染或显微注射。

激活时间因细胞系而异，通常在 1–4 小时内达到最大激活水平。

由于激活不可逆，长时间实验（≥4 小时）无需补加试剂。

纯度分析

CN03 的纯度通过 4–20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，经考马斯亮蓝染色，再使用扫描密度法进行评估。测定结果显示纯度 >80%。尽管并非绝对纯品，但该纯度已足以满足绝大多数活细胞功能实验的要求，且剩余组分不影响其生物活性。

生物活性测定

验证方法

CN03 的生物活性通过其在活 Swiss 3T3 细胞中激活 RhoA 的能力进行验证。使用 RhoA G-LISA 检测试剂盒（BK124） 定量测定活化水平。

活性数据

以 1 ug/ml 处理细胞，1–2 小时内可产生约 10 倍的 RhoA 激活。

包含单点失活突变（催化结构域关键氨基酸替换）的突变蛋白在相同检测中显示零活性，证明 CN03 的激活作用完全依赖于其酶催化活性。

细胞系依赖性

不同细胞系对 CN03 的响应存在差异。建议在实验前对特定细胞系进行时间梯度（1、2、4、6 小时）和浓度梯度（0.1、0.5、1、2 ug/ml）的预实验，以确定最佳处理条件。

典型激活时间曲线

1 小时：可检测到显著激活（约 5–6 倍）

2 小时：达到约 10 倍激活

4 小时：达到峰值（10–15 倍），并维持至至少 4 小时

六、实验注意事项

1. 不可逆性：CN03 激活的 Rho 无法通过洗涤或添加抑制剂逆转，因此不适用于需要“关闭”信号的时间分辨实验。

2. 细胞类型差异：原代细胞或某些悬浮细胞可能需要更高的浓度（最高 2 ug/ml）或更长的孵育时间（4–6 小时）。

3. 对照设置：建议同时设置未处理对照和热灭活（95°C 10 分钟）CN03 对照，以排除非特异性效应。

4. 储存：冻干粉储存于 -20°C，干燥避光。重构后建议在 4°C 下 1 周内使用，或分装冻存于 -80°C（避免反复冻融）。