1 蛋白质序列的检索
1.1 从 NCBI 检索蛋白质序列
http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Protein

一般来说,利用质谱数据鉴定蛋白质主要有两种方法:肽质量指纹图谱（PMF）和肽序列标签分析（sequence tag analysis）。这两种方法较传统的 N 端测序或内部 Edman 测序法敏感数百倍，其检测低限为飞摩尔（fmol）水平（如银染的 2D胶点或 1D 胶带）。

将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

收集细胞。将培养瓶置于冰上，倒掉培养基，用PBS 或生理盐水漂洗两次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-800C 保存。（收集细胞要迅 速 ，

杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。

样品制备
电泳分离
蛋白的膜转移
免疫杂交与显色――蛋白检测

制备单细胞悬液于 200μl 的 PBS 缓冲液中；
加入 2ml 预冷的 70%乙醇，4℃保存；

组织病理技术组织处理：1.取新鲜组织厚度不超过 5mm，10% 中性福尔马林固定，大于 24 小时。2.固定后冲水 12-24 小时，3.75%酒精，1 次，1 小时，4.85%酒精，1 次，1 小时，5.95%酒精，3 次，1 小时

一、目的基因的克隆（以pshuttl-CMV质粒为例）1.选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入 pshuttl-CMV 质粒多克隆位点。

ELISPOT1.PBS 溶解抗原为 30 μg/ml，加 100 μl/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜；2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μl 封闭 1 小时，37 oC；3. 准备脾

1.将 E.coli /phage lysate 以 1:10-20 稀释在 TBST 溶液中。
2.将 4 张 82mm 的 nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的 E.coli/ phage
lysate 中，室温下水平摇动 30 分钟，取出 NC 并使膜沥干。
3.用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。