免疫沉淀-裂解缓冲液和裂解物制备

免疫沉淀步骤

免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将我们感兴趣的一种蛋白质的抗体与细胞提取液孵育，以使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用蛋白A/G 耦合的琼脂糖凝胶，从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离出来。然后样品可以通过SDS-PAGE 分离出来进行Western blot 分析。

一、裂解缓冲液

理想的裂解液将保留蛋白质的天然构象，将抗体结合位点变性减到最少，同时从样本中释放足够量的蛋白质，以满足接下来的分析。非离子型去污剂比如NP - 40 和Triton X-100 比离子型去污剂如SDS 和脱氧胆酸钠要温和一些。其它可以影响到IP 成功的因素包括盐浓度、二价阳离子浓度和pH 值。因此，要按如下范围优化这些变量（摘自Harlow and Lane，231 页，见参考部分67 页）：

 0-1 M盐

 0.1-2％ 去污剂，非离子型

 0.01-0.5％ 去污剂，离子型

 0-10 mM 二价阳离子

 0-5 mM EDTA

 pH 值：6-9

各种裂解液配方可以参考缓冲液部分：第11 章，第71 页。

变性裂解液

用于去污剂可溶性抗原，并且抗体可识别其天然构象。

1.RIPA（放射免疫沉淀法）缓冲液

比裂解液NP - 40 或Triton X -100 更能使蛋白质变性，RIPA 缓冲液含有离子型去污剂SDS 和脱氧胆酸钠作为活性成分，对裂解核膜进行核内提取特别有用。RIPA 缓冲液可以降低背景，但同时可使某些蛋白变性，包括蛋白激酶。

2. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解液

使用含EDTA 和叠氮钠的PBS。有些可溶性蛋白不需要使用去污剂。对细胞使用此缓冲液并加上机械破损，例如反复通过注射器或用Dounce 匀浆器匀浆。

3. 变性裂解液或用于不溶性抗原缓冲液的去污剂

天然蛋白质的抗原表位总是不容易靠近只识别变性蛋白质的抗体。当收集和裂解细胞时，用变性裂解液加热细胞。这个方法也可用于非离子型去污剂不能从细胞中提取的抗原。用DNase1 将有助于从染色质中提取蛋白质。

9.1b 其他试剂

       蛋白酶抑制剂

一旦裂解发生，水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样本在冰上或始终在4°C 存放以及一开始就往裂解液中加入适当抑制剂的话，这些反应将可以大大减缓。混合（“鸡尾酒”）的蛋白酶和磷酸酶抑制剂已经商品化了。如果不使用混合的蛋白酶抑制剂，IP 实验中最常用的两种蛋白酶抑制剂是PMSF（50μg/ml）和抑肽酶（1μg/ml）。磷酸酶和蛋白酶抑制剂的详细资料，请参阅我们的蛋白质免疫印迹实验指南。所需的其他试剂：

? 无菌PBS pH 值7.4

? 无菌PBS-牛血清白蛋白1％ W/ V（过滤）

? TBST 缓冲液

? 蛋白免疫印迹实验的加样/样品缓冲液

? 100 mM EDTA 贮备液：1.86g EDTA 溶解到40ml 水中。加氢氧化钠调整pH 至7.4。最后定容到50ml。

二、裂解物制备

       培养细胞的裂解

非变性：
       1. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的PBS洗涤细胞。

2. 吸干PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每107 细胞/ 100mm2 培养皿/150cm2 培养瓶加1ml，每5x106 细胞/ 60mm2 培养皿/ 75cm2培养瓶加0.5ml）。

3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的EP 管中。

4. 4°C 持续振荡30 分钟。

5. 放入微型离心机4°C 离心。

您可能要根据细胞的类型更改离心力和时间。一个准则就是12,000rpm 20 分钟，但是这必须由最终用户决定（如白细胞需要轻度
离心）。

6. 从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。

变性：

1.加100μl 变性裂解液至0.5-2 × 107 个细胞中。

2. 用涡旋混合器最大速度剧烈震荡2-3 秒。将细胞悬液转入EP 管。

(由于DNA 的释放，这步的溶液是粘性的。)

3. 样品加热95°C 5 分钟变性。

4. 用0.9 ml 非变性裂解液稀释悬液,轻轻混合。（非变性裂解液中过量1％ Triton X – 100 可以淬灭原来变性缓冲液中的SDS）。

5. 将裂解的悬液通过1ml 注射器针头5-10 次，把DNA 打成片段。

(重复机械断裂直到把粘度降低到可操作的程度。如果DNA 没有完全消化成片段，就会影响离心后分离上清和沉淀。）

6. 冰上孵育5 分钟。

7. 进行免疫沉淀反应。

裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到agarose (琼脂糖)或Sepharose beads (凝胶琼脂糖珠)。用无关抗体或血清预清除，可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白质是由免疫印迹实验检测，预清除未必必要，除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。

1.加入50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体（一些研究人员首选兔，参考Harlow and Lane，243 页）到1ml 裂解物中，在冰上孵育1 小时。

2.加入100μl 珠浆。

3. 4°C 孵育10-30 分钟并轻轻搅拌。

4. 微型离心机14000g 4°C 离心10 分钟。

5. 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。

为了提高收率，珠子可用裂解液洗涤1 或2 次以上，并将上清收集在一起。

重要的是要确保尽可能多的去除正常血清，这是因为它会与特异抗体竞争靶抗原。为了检查这一点，可以做一个测试：用裂解缓冲液代替样品，如上进行所有预清除步骤。考马斯蓝染色的凝胶将显示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清没有得到充分去除，泳带将出现在50 和25 kDa 处，这是重链和轻链，它的存在可能导致一个弱的免疫沉淀反应。在预清除步骤，考虑降低血清量或增加与您的样品孵育的珠子数量。

组织裂解

1.用干净器械解剖所要的组织，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮中“速冻”。样本在-80°C 储存备以后使用或放在冰上立即匀浆。

3. 对于约5mg 组织，向管中迅速加入约300μl 裂解液并用电动匀浆器均浆。

4. 裂解液冲洗刀片两次，每次300μl，然后4°C 持续振荡2 小时（将回旋振荡器放入冰箱）。

裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便凝胶上样。最小浓度
为0.1mg/ml；最佳浓度为1-5mg/ml。

（注：如果样品需要变性，使用变性裂解液。）

5. 微型离心机4°C 12000rpm 离心20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管（放在冰上）中，
弃沉淀。