欢迎您访问武汉艾美捷科技有限公司官方网站!
站点地图 服务热线:400-6800-868
  • 产品
  • 文章

TECHNICAL COLUMN

学习资源

当前位置:首页 > 学习资源

免疫沉淀-裂解物的预清除程序和免疫沉淀

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-05-10     
分享到:


一、裂解物的预清除程序


裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到agarose (琼脂糖)或Sepharose beads (凝胶琼脂糖珠)。用无关抗体或血清预清除,可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是,如果最后蛋白质是由免疫印迹实验检测,预清除未必必要,除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。


1.加入50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体(一些研究人员首选兔,参考Harlow and Lane,243 页)到1ml 裂解物中,在冰上孵育1 小时。

2.加入100μl 珠浆。

3. 4°C 孵育10-30 分钟并轻轻搅拌。

4. 微型离心机14000g 4°C 离心10 分钟。

5. 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。


为了提高收率,珠子可用裂解液洗涤1 或2 次以上,并将上清收集在一起。


重要的是要确保尽可能多的去除正常血清,这是因为它会与特异抗体竞争靶抗原。为了检查这一点,可以做一个测试:用裂解缓冲液代替样品,如上进行所有预清除步骤。考马斯蓝染色的凝胶将显示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清没有得到充分去除,泳带将出现在50 和25 kDa 处,这是重链和轻链,它的存在可能导致一个弱的免疫沉淀反应。在预清除步骤,考虑降低血清量或增加与您的样品孵育的珠子数量。


二、免疫沉淀


1.在冰上预冷离心管中加入10-50μg 含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。


通常在预实验中,通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。

您可以查看抗体数据表获得建议抗体的浓度。以下供参考使用:


1-5μl 多克隆抗体血清

1μg 亲和纯化的多克隆抗体

0.2-1μl 腹水(单克隆抗体)

20-100μl 培养液上清(单克隆抗体)


2. 样品和抗体孵育的固定时间4°C 1-12 小时(过夜),最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。

3. 同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体,选择蛋白G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体,蛋白A 偶联琼脂糖珠通常是适合的(请参阅“选择蛋白珠”表9.5 下文)。如果买来的珠子是粉末,100mg 的珠子与1ml 0.1M PBS 孵育,洗1 小时后珠子膨胀起来,然后离心,去除上清。加入1ml 含0.1% BSA (牛血清白蛋白) PBS,混合1 小时,PBS 洗涤2 次。去除上清并加入400μl 含蛋白酶抑制剂的缓冲液(可与裂解液相同)就可以使用了。它可以在4°C 储存几天;在含0.02% 叠氮钠的PBS 里会保存更长时间(使用当天用新鲜裂解液充分洗涤珠子)。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。


(最好是用尖端切掉的移液吸头,以防破坏珠子。IgM抗体:不要使用蛋白A或蛋白G结合珠子。使用山羊抗小鼠 IgM(或多价Ig 或抗重链)的珠子。)


4. 浆料混合好,向每个样本中加入70-100μl。始终保持样品在冰上。珠子将倾向于粘着吸头,所以尽量减少珠子在吸管中运动并使用从尖端切断5mm 的吸头。

5. 裂解珠子混合液4°C 孵育4 小时并旋转振荡(最佳孵育时间可由预实验确定)。

6. 当孵育结束后,管子离心,去除上清液并用细胞裂解液洗涤珠子3 次(每次4°C 离心去除上清)。

7. 最后,去除最后一次上清并加入25-50μl 2×上样缓冲液。95-100°C 煮沸5 分钟,以变性蛋白质并将其与蛋白- A /G 珠子分离,随后离心并保持上清含有蛋白质。然后,您可以冻存样品或进行SDS – PAGE 电泳。


使用上样缓冲液是最苛刻的洗脱方法,也将洗脱任何非共价结合的抗体和抗体片段,这将显示在免疫印迹胶中。抗原可用温和的甘氨酸梯度洗脱(高达1M),以减少抗体洗脱量。

  • 高品质保障 成熟的生产研发技术
  • 高性价比 价宜质优,性价比高
  • 高效省心 从购买到使用,放心无忧
  • 安全运输 完善的保护措施安全运输

微信扫码在线客服

微信咨询

全国免费技术支持

400-6800-868

在线客服