OxiSelect 48孔彗星检测试剂盒：操作流程与数据分析指南

一、研究背景

DNA损伤是细胞在环境因素（如紫外线、化学诱变剂）及自身代谢过程（如氧化磷酸化产生的活性氧）双重作用下持续发生的分子事件。据统计，每个哺乳动物细胞每天约发生1000至100万次DNA损伤事件。尽管这一数字相对于人类基因组约60亿个碱基的总量而言比例甚低，但若关键基因（如抑癌基因、DNA修复基因）上的损伤未能被及时正确修复，将导致细胞功能紊乱，显著增加肿瘤发生的风险。

彗星检测，亦称单细胞凝胶电泳，是目前评估单个细胞DNA损伤程度最常用的技术之一。其原理是：在电场作用下，含有链断裂或碱基损伤的DNA片段因分子量较小、负电荷较多，会从细胞核中迁移出来，与完整DNA分离，经DNA荧光染料染色后，在显微镜下呈现形似“彗星”的拖尾图像。研究人员通常通过测量彗尾长度、尾部DNA百分比及尾矩等参数对DNA损伤进行定量分析。

二、产品概述与检测原理

由艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect 48孔彗星检测试剂盒（货号：STA-845），是一种快速、灵敏的细胞DNA损伤检测方案。每套试剂盒可完成48次检测（48孔专用玻片一块），适用于药物筛选、环境毒理学评价及DNA修复机制研究。

检测原理（碱性彗星检测流程）：

1. 细胞包埋：将待测单细胞悬液与熔融的低熔点琼脂糖按比例混合，迅速加样至48孔彗星检测专用玻片的各孔中，4℃凝固，使细胞固定于琼脂糖凝胶微环境内。

2. 裂解与解旋：加入裂解缓冲液（含高浓度盐和去垢剂）去除细胞膜、胞浆蛋白及核膜，暴露核DNA；随后用碱性溶液处理，使DNA双链解旋变性，并将DNA单链断裂和双链断裂转化为可迁移的单链缺口。

3. 电泳：在水平电泳槽中进行碱性电泳（推荐条件：33 V，300 mA，15分钟）。受损DNA片段因其分子量小、带负电荷，在电场中迁移距离长；完整DNA因分子量大、超螺旋结构复杂，迁移距离短。

4. 染色与观察：电泳结束后，干燥玻片，用DNA染料（如Vista Green）染色，通过荧光显微镜（激发波长约490 nm，发射波长约520 nm）观察并采集图像。受损细胞呈现典型的“彗星”形态，拖尾长度和尾部荧光强度与DNA损伤程度正相关。

三、试剂盒组分与储存

试剂盒在室温下运输，各组分及储存要求如下：

组分名称 | 货号 | 规格 | 储存条件

48孔彗星检测专用玻片 | STA-846 | 1块（48孔） | 室温

彗星琼脂糖（无菌） | 235002 | 15 mL瓶 | 室温

Vista Green DNA染料（10000×） | 235003 | 5 ?L管 | -20℃

EDTA溶液（500 mM） | 235004 | 50 mL瓶 | 室温

10×裂解液 | 235005 | 20 mL瓶 | 室温

用户自备材料：

NaCl粉末、NaOH颗粒、10 N NaOH（用于pH调节）

DMSO（可选）、70%乙醇

TE缓冲液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）

PBS（不含Mg??和Ca??）、去离子水

EDTA（二钠盐）

四、试剂配制方法

1. 彗星琼脂糖的液化

将琼脂糖瓶置于90-95℃水浴中加热20分钟，直至琼脂糖完全熔融。随后转移至37℃水浴中平衡20分钟，并保持于37℃待用（避免提前凝固）。注意：加热时瓶盖应略微旋松以防爆裂，液化后不可重新加热。

2. Vista Green DNA染液（1×）

将10000×浓缩染料用TE缓冲液按1:10000比例稀释（例如：5 ?L染料 + 50 mL TE缓冲液）。染液可在4℃避光保存3周。该染料灵敏度高，使用前应充分混匀，避免反复冻融。

3. 1×裂解液（以配制100 mL为例）

组分 | 终浓度 | 加入量

10×裂解液 | 1× | 10 mL

NaCl | 2.5 M | 14.6 g

EDTA（自备） | 100 mM | 3.72 g

去离子水 | — | 补至100 mL

配制步骤：称取NaCl和EDTA，加入约80 mL去离子水溶解；再加入10 mL 10×裂解液，搅拌至完全溶解；用去离子水定容至100 mL。调节pH至10.0（使用10 N NaOH）。若实验需要抑制核酸酶活性，可临用前加入DMSO至终浓度10%。

五、结果计算与分析

DNA损伤通过测量细胞核遗传物质（彗头）与迁移产物（彗尾）之间的位移进行定量。最常用的两个参数为尾部DNA百分比和尾矩。建议每个样本至少分析50-100个细胞，以获得统计学意义。

图3：彗星实验中的典型受损DNA。

Tail DNA% = 100 x Tail DNA Intensity/CellDNA IntensityTail Moment can be measured using one of thefollowing methods:

(a) Olive Tail Moment = Tail DNA% x TailMoment Length*

(b) Extent Tail Moment = Tail DNA% x Length ofTail (见上图)

A number of Comet Assay analysis softwareprograms are commercially available, such as andComet Assay IV (Perceptive Instruments) andCASPlab.

*Tail Moment Length is measured from the centerof the head to the center of the tail (see Figure 3)

六、相关产品信息

如需更高或更低通量，可选用以下同系列产品：

DNA双链断裂染色试剂盒 | STA-321

氧化性DNA损伤定量试剂盒（AP位点） | STA-324

3孔彗星检测试剂盒 | STA-350 | 15次检测

24孔彗星检测试剂盒 | STA-835 | 24次检测

96孔彗星检测试剂盒 | STA-855 | 96次检测

七、注意事项

1. Vista Green DNA染料需严格储存于-20℃，其他组分室温保存即可。染色液配制后应在3周内使用。

2. 低熔点琼脂糖与细胞混合前需冷却至37℃左右，以免热损伤细胞。

3. 电泳条件（电压、电流、时间）应根据细胞类型和预期损伤程度进行预实验优化。图示结果（依托泊苷处理Jurkat细胞）仅供参考。

4. 实验全程应避光操作（特别是染色后），防止荧光淬灭。

5. PBS必须不含Mg??和Ca??，否则可能影响琼脂糖凝固及细胞包埋效果。

文献参考：

1. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Micro gel electrophoretic study of radiation induced DNAdamages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique forquantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res. 175, 184–191.

3. Olive, P. L., Banath, J. P., and Durand, R. E. (1990a). Heterogeneity in radiation induced DNAdamage and repair in tumor and normal cells using the "Comet" assay. Radiat. Res. 122, 86–94.4. De Boeck, M., Touil, N., De Visscher, G., Vande, P. A., and Kirsch-Volders, M. (2000). Validationand implementation of an internal standard in Comet assay. Mutat. Res. 469, 181–197.