OxiSelect碱性晕圈检测试剂盒：适用于单细胞水平DNA损伤的高通量评价

DNA损伤是细胞在环境因素（如紫外线、化学诱变剂）及自身正常代谢过程（如氧化呼吸链产生的活性氧）共同作用下持续发生的分子事件。据统计，每个细胞每天约发生1000至100万次DNA损伤事件。虽然这一数字相对于人类基因组约60亿个碱基的总量而言占比甚微，但若关键基因上的损伤未能被及时正确修复，将阻碍细胞正常功能，并显著增加癌变风险。

目前已有多种方法用于检测DNA损伤，其中彗星检测（单细胞凝胶电泳）是应用最广泛的技术之一。在电场作用下，受损DNA（含碎片和链断裂）与完整DNA分离，在显微镜下呈现经典的“彗星拖尾”形态。然而，Sestili和Cantoni（参考文献1）开发了一种新型单细胞检测技术——碱性晕圈法。该方法无需电泳步骤，而是利用损伤DNA片段在碱性低渗缓冲液中通过琼脂糖凝胶孔径的径向扩散，且扩散距离与DNA片段大小呈反比。“晕圈”一词描述了损伤DNA从分离的细胞核中径向扩散后形成的形态。

与彗星检测相比，碱性晕圈法具有操作更简单、更快速的优点（尽管彗星检测在灵敏度上仍略胜一筹）。艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect碱性晕圈检测试剂盒（货号：STA-890）是一种快速、灵敏的细胞DNA损伤检测方案，每套试剂盒可完成15次检测。

一、检测原理

OxiSelect碱性晕圈检测试剂盒是一种基于单细胞水平的DNA损伤检测方法，其原理与操作流程如下：

1. 细胞包埋：将待测单细胞悬液与熔融的晕圈专用琼脂糖按比例混合，迅速加样至OxiSelect晕圈检测专用玻片（3孔规格）的各孔中，4℃凝固，使细胞固定于琼脂糖凝胶微环境内。

2. 裂解与碱性扩散处理：包埋后的细胞加入晕圈扩散缓冲液和碱性溶液进行处理。该缓冲液为低渗碱性体系，可破坏细胞膜和核膜，释放出细胞核；同时，碱性条件使DNA双链解旋变性，并将DNA链断裂转化为可迁移的单链缺口。在此条件下，受损DNA片段因其分子量较小，能够通过琼脂糖凝胶的孔隙发生渗透性径向扩散；而完整DNA由于分子量大、超螺旋结构复杂，扩散能力极弱。

3. 晕圈形成与观察：经过碱性扩散处理后，损伤DNA从细胞核中心向四周扩散，形成环形的“晕圈”形态（见图1）。用Vista Green DNA染料染色后，在荧光显微镜下可清晰观察到：未损伤细胞核呈致密的圆形荧光点，无晕圈或晕圈极窄；损伤程度越高的细胞，晕圈直径越大，边缘荧光越弥散。

4. 结果量化：通过计算核扩散因子对每个样本的DNA损伤程度进行定量。核扩散因子的计算方法通常为：（晕圈直径）/（核直径），或通过图像分析软件测量晕圈面积与核面积的比值。建议每个样本至少分析50个细胞。

二、试剂盒组分与储存

试剂盒在室温下运输，各组分及储存要求如下：

组分名称 | 货号 | 规格 | 储存条件

3孔碱性晕圈检测专用玻片 | STA-892 | 5块（共15孔） | 室温

晕圈琼脂糖（无菌） | 289001 | 15 mL瓶 | 室温

10×晕圈扩散缓冲液 | 289002 | 20 mL瓶 | 室温

EDTA溶液（500 mM） | 235004 | 50 mL瓶 | 室温

10×晕圈碱性溶液 | 289003 | 20 mL瓶 | 室温

Vista Green DNA染料（10000×） | 235003 | 5 uL管 | -20℃ |

储存注意事项：收到试剂盒后，Vista Green DNA染料应立即转移至-20℃保存；其他所有组分室温保存即可。染液应避免反复冻融，长期不用时建议分装保存。

三、操作流程要点

1. 细胞准备：收集待测细胞（推荐密度为1-5×105 cells/mL），用不含Mg2+和Ca2+的PBS洗涤一次。

2. 包埋：将细胞悬液与37℃预热的晕圈琼脂糖按1:10（体积比）混合，立即吸取50-100 uL滴加至玻片各孔中，4℃凝固10分钟。

3. 裂解与扩散：每孔加入预冷的1×晕圈扩散缓冲液（含碱性溶液），4℃孵育20-30分钟。

4. 中和与固定：用去离子水轻轻洗涤玻片，再用70%乙醇固定5分钟。

5. 染色：加入1×Vista Green DNA染液，室温避光染色15分钟。

6. 观察与分析：在荧光显微镜下（激发波长约490 nm，发射波长约520 nm）观察并采集图像。使用图像分析软件测量核直径和晕圈直径，计算核扩散因子。

四、结果示例

图: H2O2处理293细胞。在进行碱性卤素试验前，293细胞未处理（上图）或用1mM H2O2处理30分钟

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六、注意事项

1. 操作简便性：碱性晕圈法的最大优势在于无需电泳设备，仅需常规水浴、冰箱和荧光显微镜即可完成，适合实验室条件有限或需要快速初筛的场景。

2. 灵敏度对比：虽然碱性晕圈法操作更简便，但彗星检测对低水平DNA损伤的灵敏度更高。对于需要高灵敏度的研究，建议优先考虑彗星检测；对于药物筛选等需要高通量、快速比较的实验，碱性晕圈法是理想选择。

3. 染色保护：Vista Green DNA染料为光敏性物质，染色后应尽快在荧光显微镜下观察和拍照，避免长时间光照导致荧光淬灭。

4. 琼脂糖温度控制：琼脂糖与细胞混合前必须冷却至37℃左右，温度过高会导致细胞热损伤，温度过低则琼脂糖提前凝固，无法均匀包埋。

5. 缓冲液新鲜配制：碱性扩散缓冲液应现用现配，长时间放置会导致pH漂移，影响DNA解旋效率。

文献参考：

1. Sestili P., and Cantoni O. (1999) Free Radic. Biol. Med. 26, 1019-1026.

2. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

3. Sestili P., Martinelli C., and Stocchi V.? (2006) Mutat Res 607, 205–214.