96孔板ROCK活性检测试剂盒，检测ROCK对MYPT1在Thr696位点的特异性磷酸化

Rho家族成员是信号通路中的关键调控组分，通过重排肌动蛋白细胞骨架来指导细胞运动、黏附和细胞分裂。Rho通过细胞外信号（如溶血磷脂酸，LPA）激活。Rho的作用通过下游Rho效应分子介导，其中一种效应分子是Rho相关激酶（ROCK）。目前已鉴定出两种ROCK亚型：ROCK-I（也称为ROKβ）和ROCK-II（也称为Rho激酶和ROKα）。ROCK通过磷酸化多个底物介导Rho信号传导，并重排肌动蛋白细胞骨架，这些底物有助于肌动蛋白丝的组装和收缩性。例如，ROCK通过特异性磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1（MYPT1）的Thr696位点使肌球蛋白磷酸酶失活，从而导致20 kDa肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化含量增加。

Cell Biolabs的96孔ROCK活性检测试剂盒是一种酶免疫测定法，用于检测ROCK对MYPT1在Thr696位点的特异性磷酸化。该试剂盒的微孔板预先涂覆了重组MYPT1。将底物孔与ROCK样本（如纯化的激酶、细胞或组织裂解液）孵育后，通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测磷酸化的MYPT1。

艾美捷96孔板ROCK活性检测试剂盒（#STA-416）提供了一种非同位素、灵敏且特异的方法，用于通过其生理底物监测ROCK活性；它也可用于筛选ROCK抑制剂。试剂盒的检测灵敏度下限为200 pg活性ROCK-II。试剂盒还提供了重组活性ROCK-II作为阳性对照。每套试剂盒提供足够的试剂进行多达96次检测。

相关产品：

1. STA-415：ROCK活性免疫印迹试剂盒

2. STA-400：Ras激活检测试剂盒

3. STA-404：Rac/Cdc42激活检测试剂盒组合

4. STA-405：Rho/Rac/Cdc42激活检测试剂盒组合

5. STA-410：PAK1 PBD琼脂糖珠

96孔板ROCK活性检测试剂盒组成：

盒子1（室温运输）：

1. ROCK底物涂覆板（部件编号241601）：一个预先涂覆重组MYPT1的96孔板。

2. 10倍激酶缓冲液（部件编号241602）：一瓶20 mL，含250 mM Tris（pH 7.5）、100 mM MgCl?、50 mM甘油-2-磷酸、1 mM Na?VO?。

3. ATP溶液（部件编号241604）：一瓶100 ?L，含100 mM ATP。

4. 抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体（部件编号241603）：一瓶20 ?L。

5. 二抗，辣根过氧化物酶偶联物（部件编号231009）：一瓶20 ?L。

6. 检测稀释液（部件编号310804）：一瓶50 mL。

7. 10倍洗液（部件编号310806）：一瓶100 mL。

8. 底物溶液（部件编号310807）：一瓶12 mL，棕色瓶。

9. 终止液（部件编号310808）：一瓶12 mL。

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. 活性ROCK-II（部件编号241505）：一瓶20 ?L，含10 ng活性ROCK-II，溶于25 mM Tris（pH 7.5）、10 mM MgCl?、5 mM甘油-2-磷酸、0.1 mM Na?VO?、10%甘油、0.1% BSA。

未提供材料：

1. ROCK样本（纯化的激酶、细胞或组织裂解液）。

2. 裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM甘油-2-磷酸、1% Triton X-100或1% Nonidet P-40、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na?VO?和蛋白酶抑制剂。

3. DTT。

4. 0.5 M EDTA。

5. 30°C恒温箱或水浴。

6. 能在450 nm（620 nm作为可选参考波长）读取的酶标仪。

储存：

将活性ROCK-II储存于-80°C，ATP溶液储存于-20°C，其余试剂盒组分储存于4°C。避免多次冻融循环。

结果示例：

以下图表展示了使用Cell Biolabs的96孔ROCK活性检测试剂盒获得的典型结果。以下数据仅供参考。

图1：ROCK-II活性检测

左图：活性ROCK-II在30°C下孵育60分钟。

右图：2.5 ng活性ROCK-II在30°C下按所示时间孵育。通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测MYPT1底物的磷酸化，具体方法见检测协议。

图2：ROCK-II活性免疫印迹检测

将含有10 ng活性ROCK-II的1倍激酶缓冲液（25 ?L）与含有0.2 mM ATP和500 ng重组MYPT1的1倍激酶缓冲液（50 ?L）在30°C下孵育30分钟。通过加入25 ?L 4倍SDS-PAGE样品缓冲液终止激酶反应。泳道1、3、5、7：无激酶（阴性对照）；泳道2、4、6、8：有激酶。将200 ng（泳道1和2）、100 ng（泳道3和4）、50 ng（泳道5和6）或25 ng（泳道7和8）的重组MYPT1底物加载到SDS-PAGE上。通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测MYPT1底物的磷酸化，具体方法见产品编号STA-415的检测协议。

96孔板ROCK活性检测试剂盒文献参考：

1. Etienne-Manneville, S., and Hall, A. (2002) Nature 420, 629-635.

2. Riento, K., and Ridley, A. J. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446-456.

3. Leung, T., Manser, E., Tan, L., and Lim, L. (1995) J. Biol. Chem. 270, 29051-29054.

4. Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chihara, K., Nakafuku, M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,

K., Iwamatsu, A., and Kaibuchi, K. (1996) EMBO J. 15, 2208-2216.

5. Totsukawa, G, et al., J. Cell Biol. (1999) 144, 735-744.