OxiSelect 蛋白羰基ELISA检测试剂盒，化学性质稳定标志物检测，适用多种氧化应激模型

产品概述

由艾美捷代理Cell Biolabs推出的OxiSelect?蛋白羰基ELISA检测试剂盒（货号：STA-310）提供了一套简便的酶免疫方法，用于快速检测和定量生物样本中的蛋白羰基含量。本试剂盒采用96孔板形式，先将蛋白样品吸附于板孔，再与DNPH反应衍生化，通过抗DNP抗体和HRP标记二抗进行检测。与传统方法相比，本试剂盒无需对低蛋白浓度样品（<4 mg/mL）进行TCA沉淀浓缩，最低仅需10 ug/mL蛋白样品即可检测，有效避免了沉淀导致的羰基值损失和蛋白损耗。每套试剂盒可完成96次检测（含标准曲线及待测样品）。

蛋白羰基的生物学意义

蛋白氧化被定义为蛋白质的共价修饰，可由活性氧（ROS）直接诱导，或由氧化应激的次级副产物间接介导。蛋白质的氧化修饰可在体外由多种促氧化剂诱导，也可在体内衰老过程和某些疾病状态下发生。蛋白氧化修饰类型繁多，生物样本中最常见的蛋白氧化产物是脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸残基的羰基衍生物。这些衍生物化学性质稳定，是大多数类型ROS引起的氧化应激的可靠标志物。

传统的蛋白羰基检测方法通常先将样品与DNPH反应衍生化，再通过抗DNP抗体进行免疫印迹检测。Buss等开发的蛋白羰基ELISA方法要求蛋白样品浓度>4 mg/mL，低浓度样品需经TCA沉淀浓缩方可检测。然而，TCA沉淀会导致总羰基值约20%的损失，同时伴随显著的蛋白损耗。本试剂盒采用独特的“先吸附后衍生”技术路线：蛋白样品首先吸附于96孔板孔底，随后再与DNPH反应。这一设计使低蛋白浓度（<4 mg/mL）的实验和临床样品无需浓缩即可直接检测，最低仅需10 ug/mL蛋白样品，在保持检测灵敏度的同时最大限度保留了样本原始信息。

检测原理

本试剂盒的检测原理如下：BSA标准品或蛋白样品（10 μg/mL）于37℃吸附于96孔板2小时；样品或标准品中存在的蛋白羰基被DNPH衍生化为DNP腙；随后依次与抗DNP抗体和HRP标记的二抗孵育；加入底物显色后，以酶标仪读取吸光度。样品中蛋白羰基含量通过与已知还原型/氧化型BSA标准品制备的标准曲线进行比较计算得出。试剂盒提供的氧化型BSA标准品经分光光度法预先标定，羰基含量为7.5 nmol/mg蛋白。

试剂盒组分与储存

本试剂盒室温运输，收到后请按要求储存：

组分 | 规格 | 储存条件

96孔蛋白结合板 | 1块 | 4℃

抗DNP抗体（1000×） | 20 uL | 4℃

HRP标记二抗（1000×） | 20 uL | 4℃

25× DNPH溶液 | 500 uL（琥珀色瓶） | 4℃

2× DNPH稀释液 | 15 mL | 4℃

封闭剂 | 20 g | 4℃

10× 洗涤缓冲液 | 100 mL | 4℃

底物溶液 | 12 mL（琥珀色瓶） | 4℃

终止液 | 12 mL | 4℃

还原型BSA标准品 | 200 uL，1 mg/mL | -20℃分装

氧化型BSA标准品 | 200 uL，1 mg/mL（7.5 nmol/mg） | -20℃分装

需自备材料

蛋白样品（纯化蛋白、血浆、血清、细胞裂解液或组织匀浆）

1× PBS

乙醇

操作流程

1. 样品制备

用1× PBS将蛋白样品稀释至10 ug/mL（若样品浓度低于10 ug/mL，需适当调整上样体积确保总蛋白量充足）

血清、血浆样本可直接稀释后使用

2. 标准曲线配制

以1× PBS稀释还原型BSA和氧化型BSA标准品（1 mg/mL），制备系列混合标准品（含不同比例的还原型/氧化型BSA）

建议每批次实验新鲜配制标准品

3. 蛋白吸附

每孔加入100 μL稀释后的样品或标准品

以封板膜覆盖，37℃孵育2小时

弃去孔内液体，以洗涤缓冲液洗涤

4. 封闭与衍生化

每孔加入200 uL封闭液，室温孵育1小时

洗涤后，每孔加入100 uL DNPH工作液，室温避光孵育45分钟（DNPH需以乙醇配制，具体比例见说明书）

弃去DNPH溶液，以洗涤缓冲液充分洗涤

5. 免疫检测

每孔加入100 μL稀释后的抗DNP抗体，室温孵育1小时

洗涤后，每孔加入100 uL稀释后的HRP标记二抗，室温孵育1小时

洗涤后，每孔加入100 uL底物溶液，室温避光孵育

待标准品孔出现明显颜色梯度后，每孔加入100 uL终止液

以酶标仪读取450 nm吸光度

质控建议：

1. 标准曲线：每次实验重新配制，确保R? ≥ 0.99

2. 样品稀释：若样品OD值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数后重新检测

3. 背景控制：以1× PBS替代样品作为空白对照

4. DNPH新鲜配制：DNPH溶液建议现用现配，避免长时间暴露于光线

5. 洗涤充分性：DNPH衍生化后需充分洗涤以去除未反应的DNPH，否则可能导致高背景

应用场景

本试剂盒适用于：氧化应激相关疾病（如神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、慢性炎症等）中蛋白氧化损伤水平的评估；抗氧化药物或天然产物的抗氧化功效评价；不同实验条件下（如缺氧、毒素暴露等）细胞或组织蛋白氧化程度的比较研究；以及年龄相关疾病中蛋白氧化累积的机制探索。配套的硝基酪氨酸ELISA试剂盒（STA-305）、蛋白羰基免疫印迹试剂盒（STA-308）及AGE/CML检测试剂盒可联合使用，实现多维度氧化应激损伤的综合评估。

文献参考

1. Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, CI., and Stoppani, AO. (1977). Archives of Biochemistry &Biophysics 180:248 257.

2. Wakeyama, H., Takeshige, K., Takayanagi, R., and Minakami, S. (1982). Biochem J. 205:593601.

3. Talent, JM., Kong, Y., and Gracy, RW. (1998). Anal. Biochem. 263:31 38.

4. Buss, H, Chan, TP, Sluis, KB, Domigan, NM, and Winterbourn, CC. (1985) Free Radic Biol Med.23:361-6.

5. Reznick, AZ., and Packer, L. (1994) Methods Enzymol. 233:263-357.