PAK-PBD磁珠使用指南：Rac/Cdc42活性蛋白分离与检测

产品概述

由艾美捷代理Cytoskeleton推出的PAK-PBD磁珠（货号 PAK02）是一种用于分离细胞和组织裂解液中活化态（GTP 结合型）Rac 与 Cdc42 蛋白的亲和试剂。该产品将人 p21 活化激酶 1（PAK1）的 Rac/Cdc42 结合结构域以 GST 标签融合蛋白的形式在细菌表达系统中过表达，并偶联至带有颜色的谷胱甘肽琼脂糖磁珠上，可实现对活性 Rac/Cdc42 的特异性捕获。

产品特性

重组蛋白涵盖 PAK1 的第 67–150 位氨基酸，包含高度保守的 PBD 区域（又称 CRIB 区域）及与 GTP-Rac、GTP-Cdc42 高亲和力结合所需的序列。该重组蛋白 N 端带有 GST 标签（28 kDa），整体分子量约为 34 kDa。每管 PAK-GST 蛋白磁珠含 500 ?g 蛋白，以粉紫色冻干粉形式提供，单管约可完成 25 次实验。

经 12% SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色及扫描光密度测定，该蛋白纯度约为 88%。

生物学活性

PAK-PBD 磁珠对 Rac 与 Cdc42 的活性形式（GTP 结合型）具有选择性结合能力，而对非活性形式（GDP 结合型）亲和力极低。标准验证实验采用 20 ?l 磁珠与 300 ?g 裂解液，分别以 GTPγS（不可水解的 GTP 类似物，可将 Rac1/Cdc42 锁定于活性构象）和 GDP 加载牛脑裂解液，随后用 Rac1 或 Cdc42 特异性抗体进行免疫印迹检测。结果显示，GTPγS 样本中活性 Rac1 与 Cdc42 的信号较 GDP 样本增强 7–15 倍，充分验证了磁珠的特异性与性能。

储存与复溶

使用前先短暂离心，使产品集中于管底。每管蛋白磁珠加入 500 ?l 蒸馏水复溶至 1 mg/ml，复溶后缓冲液成分为：50 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、2.0%（w/v）葡聚糖、10%（w/v）蔗糖。磁珠基质呈紫色，便于识别。

储存时，应将彩色磁珠悬液按实验用量分装，液氮速冻后于 -70°C 保存，在此条件下可稳定保存 6 个月。建议每次实验分装 20 ?l（含 20 ?g 蛋白）。为维持高生物学活性，应避免反复冻融。未复溶的冻干磁珠在 4°C、湿度低于 10% 的干燥条件下可稳定保存 1 年。

应用建议

该产品适用于细胞或组织裂解液中活性 Rac/Cdc42 的分离与检测，每次实验需 200–1000 ?g 裂解液起始材料。典型流程包括：裂解液预处理、磁珠孵育、离心洗涤、洗脱及后续免疫印迹分析。建议同时设置 GTPγS 与 GDP 对照，以验证实验体系的特异性与磁珠性能。

文献参考

1. Manser, E. et al. 1994. Nature. 367: 40-46.