Bioauxilium THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+总4EBP1 TR-FRET细胞信号检测试剂盒验证数据说明

磷酸化 4EBP1（T37/T46）+ 总 4EBP1 检测试剂盒是一种均相时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫检测法（图 1）。THUNDER? 细胞信号检测试验流程包括 3 个步骤（图 2）。细胞经过处理后，首先使用试剂盒提供的专用裂解缓冲液将细胞裂解。然后在不同的孔中，分别使用两对荧光标记的抗体以简单的“添加 - 孵育 - 测量”格式（单步试剂添加；无需洗涤步骤）检测细胞裂解液中的磷酸化 4EBP1（T37/T46）和总 4EBP1。对于磷酸化蛋白的检测，一个抗体标记有供体荧光团（Europium 配合物；Eu-Ab1），另一个标记有远红光受体荧光团（FR-Ab2）。检测总蛋白的第二对抗体对（Eu-Ab3 和 FR-Ab4）也采用相同的方法。两种匹配的标记抗体结合到目标蛋白（磷酸化 4EBP1 或总 4EBP1）的不同表位上，使两种染料靠近。用闪光灯（320 或 340 nm）或激光（337 nm）激发供体 Europium 配合物分子，会触发从供体到受体分子的 FRET，受体分子随后在 665 nm 处发射 TR-FRET 信号。Eu 配合物的剩余能量在 615 nm 处产生光。665 nm 处的信号与细胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和总 4EBP1 的浓度成正比。数据可以表示为 665 nm 处的信号，或 665 nm/615 nm 的比值。

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THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+总4EBP1 TR-FRET细胞信号检测试剂盒组分：

铕磷-4EBP1（20uL）

钙磷-4EBP1（80uL）

铕总量4EBP1（5uL）

Acc总计4EBP1（20uL）

4EBP1对照裂解液（200uL）

5X裂解缓冲液2（5 mL）

10倍TR-FRET检测缓冲液（250uL）

100X磷酸酶抑制剂鸡尾酒（250uL）

验证数据：

该试剂盒已通过验证，可用于 A431 和 HEK293 细胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和总 4EBP1 的相对定量检测，采用双板检测协议。

贴壁细胞在 96 孔细胞培养板中培养过夜（HEK293 使用 EMEM + 10% 胎牛血清；A431 使用 DMEM + 10% 胎牛血清）。用于 HEK293 的培养板预先涂覆了聚-L-赖氨酸。

细胞经过处理后，移除培养基，然后用添加了磷酸酶抑制剂（1 mM 氟化钠和 2 mM 偏钒酸钠）的 1X 裂解缓冲液 2（50 uL）将细胞裂解。

在室温下于振荡器（400 rpm）孵育 30 分钟后，将裂解液（15 uL）转移到 384 孔检测板中，然后分别加入用于检测磷酸化 4EBP1（T37/T46）的标记抗体 Eu-Ab1 和 FR-Ab2（5 uL），或用于检测总 4EBP1 的 Eu-Ab3 和 FR-Ab4（5 uL）。

在室温下孵育 4 小时后，记录 665 nm 和 615 nm 处的 TR-FRET 信号（使用 EnVision，闪光灯激发）。

BioAuxilium成立于2013年，基于其专有的TR-FRET技术，开发出了数百个用于细胞蛋白和生物标志物定量分析的Thunder系列TR-FRET检测试剂盒。该公司专注于设计、开发和生产高质量、经过充分验证的TR-FRET检测试剂盒，简化实验室工作流程，加速生物医学研究。

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