One-step TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：一步法标记DNA断裂片段，适配多平台检测

细胞凋亡过程中，基因组DNA会被内源性核酸酶切割，产生带有3′-羟基末端的双链DNA断裂片段。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术正是利用这一特征，通过TdT催化将荧光标记的dUTP添加到断裂DNA的3′-羟基末端，从而实现对凋亡细胞的直接标记和定量分析。One-step TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（货号：D-AKK2010）由艾美捷代理的Biogradetech推出的提供了一套优化的即用型检测体系，无需额外配制多种反应液，可在荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪上通过常见的FITC通道（Ex/Em=490 nm/520 nm）轻松捕获绿色荧光信号。

产品基本信息

项目 规格

货号 D-AKK2010

规格 50次检测

储存条件 -20°C避光保存，有效期6个月

所需但未提供的材料

离心机、荧光显微镜

96孔细胞培养板、精密移液器、一次性吸头

磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）

4%多聚甲醛、去离子水

蛋白酶K、组织自发荧光淬灭剂（可选）

试剂准备

所有试剂使用前需平衡至室温，按以下方法配制：

DAPI（1×）：根据实际用量，将DAPI（500×）用PBS稀释至1×。

Triton X-100（0.3%）：根据实际用量，将100% Triton X-100用PBS稀释至0.3%。

1×平衡缓冲液：根据实际用量，将5×平衡缓冲液用去离子水稀释至1×。

实验步骤

A. 样品制备

根据样品类型和检测平台选择相应的制备方法。

1. 贴壁细胞（荧光显微镜分析）

(1) 在96孔微孔板中培养细胞至少24小时，待细胞达到适宜密度。用选定的方法诱导细胞凋亡，同时设置未经诱导的对照组。

(2) 移除培养基，每孔加入50 ?L 4%多聚甲醛，室温固定30分钟。

(3) 移除固定液，每孔用200 ?L PBS洗涤3次，每次5分钟。

(4) 固定后，每孔加入50 ?L 0.3% Triton X-100，室温孵育30分钟进行透化处理。

(5) 每孔用50 ?L BSA工作液洗涤3次。

>注：对于细胞爬片或其他孔板细胞，固定液和透化剂的体积可根据实际情况调整。

完成后请继续执行步骤B（TUNEL标记）。

2. 非贴壁细胞（流式细胞术分析）

(1) 培养细胞至适宜密度（约1–2×10? cells/mL）。用选定方法诱导凋亡，同时设置对照组。

(2) 收集1–5×10?个细胞，300g离心，用0.5 mL PBS洗涤2次。

(3) 加入1 mL 4%多聚甲醛，冰上固定30分钟。

(4) 300g离心，弃上清，用1 mL PBS重悬洗涤。重复洗涤2次。

(5) 用500 ?L 0.3% Triton X-100重悬细胞，室温孵育5分钟进行透化处理（也可用100 ?g/mL蛋白酶K孵育5分钟透化）。

(6) 300g离心，弃上清，用1 mL PBS重悬洗涤，重复2次。

完成后请继续执行步骤B（TUNEL标记）。

3. 石蜡包埋组织切片（荧光显微镜分析）

(1) 脱蜡：将切片浸入二甲苯中2次，每次10–20分钟。

(2) 复水：按以下顺序依次浸洗——100%乙醇洗涤2次，每次5分钟；然后依次在95%、70%、50%乙醇中各洗涤3分钟。

(3) 用200–500 ?L PBS洗涤切片2次，每次5分钟。

(4) 吸去多余PBS，加入20 ?g/mL蛋白酶K溶液（用PBS现配），孵育15分钟。

>注：蛋白酶消化时间需根据组织类型和厚度进行优化。过度消化会导致细胞结构破坏甚至组织从载玻片上脱落；消化不足则会导致TdT标记效率降低。

(5) 终止蛋白酶处理：用PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5分钟。

完成后请继续执行步骤B（TUNEL标记）。

4. 冰冻组织切片（荧光显微镜分析）

(1) 切片在载玻片上干燥后，用200 ?L 4%多聚甲醛室温固定30分钟。

(2) 浸入200–500 ?L PBS中洗涤2次，每次5分钟。

(3) 吸去多余PBS，加入20 ?g/mL蛋白酶K溶液，孵育15分钟。

(4) 终止蛋白酶处理：用200–500 ?L PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5分钟。

>重要提示：

> 1. 组织切片常会产生自发荧光，建议使用组织自发荧光淬灭剂进行处理。

> 2.阳性对照设置（可选）：完成上述A步骤后，用10 U/mL DNase I（将5 U/?L的DNase I用PBS稀释至10 U/mL）室温消化细胞或组织10–20分钟，然后进行TUNEL标记，可作为阳性对照。

B. TUNEL标记反应（一步法）

>说明：以下为基于TUNEL一步法原理的标准操作流程，具体试剂用量和孵育时间请参照本试剂盒随附说明书。

(1)平衡：向每份样品中加入50 ?L 1×平衡缓冲液，室温平衡5–10分钟。

(2)标记反应：配制TUNEL反应混合液（含TdT酶和荧光标记dUTP），每样加入50 ?L，37°C避光孵育60分钟。阳性对照样品同步处理。

(3)终止反应：加入2×SSC溶液终止反应，室温孵育15分钟。

(4)洗涤：用PBS洗涤样品3次，每次5分钟。

(5)复染（可选）：加入50 ?L 1× DAPI工作液，室温避光孵育5分钟，以标记细胞核。

(6)封片与观察：用抗荧光淬灭封片剂封片后，于荧光显微镜下观察（绿色荧光：凋亡细胞核；蓝色荧光：所有细胞核）；若用于流式细胞术，则重悬于PBS后上机检测。

结果判读

凋亡细胞：细胞核呈明亮的绿色荧光（FITC通道），DAPI复染后核形态可清晰显示，常见核固缩、碎裂等典型凋亡形态。

非凋亡细胞：几乎无绿色荧光信号，仅见DAPI蓝色细胞核。

阳性对照（DNase I处理）：所有细胞核均呈强绿色荧光。