Annexin V-AF 488/PI细胞凋亡检测试剂盒：操作简便，结果可靠的双染法凋亡检测方案

细胞凋亡是一种由基因调控的程序性细胞死亡过程，用于清除机体中不再需要、受损或衰老的细胞。准确识别和定量凋亡细胞是药物筛选、毒性评价及基础生物学研究中的核心需求。由艾美捷代理的Biogradetech推出的Annexin V-AF 488/PI 凋亡检测试剂盒（货号：D-AKE0002）提供了一种快速、便捷的双染检测方法，可在流式细胞仪或荧光显微镜下区分早期凋亡细胞、死亡细胞和活细胞。此外，该试剂盒首次提供了专利化的凋亡阳性参考物质，有效解决了不同实验之间凋亡检测结果难以标准化的问题。

检测原理：基于磷脂酰丝氨酸外翻与膜完整性

在正常活细胞中，带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS）分布于细胞膜内侧，而膜外侧表面主要由不带电的磷脂组成。细胞进入凋亡状态后，PS被主动转运至质膜外小叶，暴露于细胞外环境中。人抗凝蛋白Annexin V是一种分子量为35-36 kDa的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力。用荧光染料（本试剂盒采用AF488，绿色荧光）标记的Annexin V能够特异性结合外翻的PS，从而标记凋亡细胞。

碘化丙啶（PI）是一种荧光核酸染料，无法透过活细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，但能进入膜完整性丧失的死亡细胞（晚期凋亡细胞和坏死细胞），与细胞核中的核酸紧密结合后发出红色荧光。因此，通过Annexin V-AF488与PI的联合染色，结合流式细胞术或荧光显微镜分析，可以清晰区分三个细胞群体：

早期凋亡细胞：细胞膜外表面暴露PS，Annexin V-AF488结合呈现绿色荧光；细胞膜完整，PI不能进入，无红色荧光。

死亡细胞（晚期凋亡/坏死）：PS外翻呈绿色荧光，同时细胞膜完整性丧失，PI进入细胞核呈红色荧光。

活细胞：PS位于膜内侧，Annexin V-AF488无法结合，且PI无法进入，几乎无荧光或仅有极弱背景。

试剂盒组分与规格

本试剂盒（50次检测规格）包含以下组分：

组分 说明

Annexin V Binding Buffer (5×) 5倍浓缩的结合缓冲液

Annexin V-AF 488 即用型，绿色荧光标记

Propidium Iodide (PI) 即用型，红色核酸染料

Apoptosis Inducer A 即用型，专利阳性凋亡诱导剂

Apoptosis Inducer B 即用型，专利阳性凋亡诱导剂

储存条件

试剂盒整体于-20°C避光保存，有效期12个月。各组分在使用前请平衡至室温。未用完的Annexin V-AF 488和PI建议分装后-20°C避光保存，避免反复冻融。凋亡诱导剂A和B同样于-20°C储存。

所需但未提供的材料

离心机

荧光显微镜或流式细胞仪

精密移液器、一次性吸头、去离子水、载玻片

细胞培养板

试剂准备

1× Annexin V结合缓冲液：使用前新鲜配制。将Annexin V结合缓冲液(5×)用去离子水稀释至1×。剩余稀释液可于4°C储存6个月。

Annexin V-AF 488：即用型，使用前平衡至室温。未用完部分分装后-20°C避光保存。

PI：即用型，使用前平衡至室温。未用完部分分装后-20°C避光保存。

凋亡诱导剂A/B：即用型，使用前平衡至室温，-20°C储存。

实验步骤

一、阳性凋亡诱导（可选，用于建立检测体系或作为对照）

1. 对于待诱导凋亡的培养细胞，按照1:1,000–1:3,000的体积比向培养基中加入凋亡诱导剂A或B（两者可单独加入，也可同时加入）。

2. 培养4、8、12、16或24小时后观察细胞凋亡情况。通常16–24小时后在光学显微镜下可见明显的细胞形态学改变，此时可用于凋亡染色观察。

> 提示：不同细胞类型对诱导剂的响应存在差异，建议根据预实验结果调整诱导时间和浓度。

二、细胞染色与检测

（详细染色步骤在原文中未完整呈现，以下为基于标准Annexin V/PI流程的补充建议，供实际操作参考）

1. 收集待测细胞（包括漂浮的凋亡细胞），用预冷的PBS洗涤一次，离心弃上清。

2. 用1× Annexin V结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至约1×10? cells/mL。

3. 取100 μL细胞悬液至流式管或离心管中，加入5 μL Annexin V-AF 488和5 μL PI。

4. 轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。

5. 加入400 μL 1×结合缓冲液，混匀后立即上机检测（流式细胞仪）或制片后于荧光显微镜下观察。

三、结果解读

活细胞（左下象限）：Annexin V-AF 488（?），PI（?），无或极弱荧光。

早期凋亡细胞（右下象限）：Annexin V-AF 488（+），PI（?），绿色荧光标记细胞膜，细胞核未染红。

死亡细胞（右上象限）：Annexin V-AF 488（+），PI（+），细胞膜绿色荧光，细胞核红色荧光。

产品优势总结

1. 双色区分三群细胞：Annexin V-AF 488（绿色）标记PS外翻，PI（红色）标记膜完整性丧失，一次染色即可获得早期凋亡、晚期凋亡/坏死和活细胞的比例。

2. 提供专利凋亡诱导剂：内置阳性质控品，解决不同实验批次间凋亡检测结果难以标准化的问题，便于方法学验证和仪器设置。

3. 兼容多平台：既适用于流式细胞仪的高通量定量分析，也适用于荧光显微镜的形态学观察。

4. 操作快捷：试剂即用型，仅需结合缓冲液稀释一步准备，染色过程约15–20分钟即可完成。

本试剂盒为细胞凋亡研究提供了一个标准化的功能检测方案，适用于药物发现、毒理学评价及细胞生物学基础研究中对凋亡事件的精准定量。