活性氧 (ROS) 含量检测试剂盒--简单、敏感、快速的ROS检测方法

活性氧自由基（ROS）是氧气正常代谢的自然产物，对细胞信号传导和稳态调节起着重要作用。在与氧化应激相关的条件下，ROS水平会显著增加。ROS的积累可能严重损伤细胞结构。氧化应激在心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、中风、炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症等研究中起着重要作用。ROS检测可帮助确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。EZMeta?活性氧自由基（ROS）检测荧光试剂盒提供了一种简单、敏感、快速的ROS检测方法。其原理基于荧光探针DCFH-DA。DCFH-DA是一种细胞渗透敏感的探针，用于检测细胞内活性氧自由基（ROS）。该探针在通过活细胞膜时会被细胞内酯酶水解为DCFH。DCFH无荧光并且不能穿透细胞膜，但可以被细胞内ROS氧化并产生荧光的DCF。然后，通过流式细胞术或荧光显微镜检测荧光信号，可以分析细胞内活性氧自由基的水平。

艾美捷Biogradetech活性氧 (ROS) 含量检测试剂盒：

货号：D-AKC1910

规格：50T / 100T

储存：储存于-20°C，避光，保存12个月

适用样本：细胞

提供的材料和储存条件：

分析程讯：

对于刺激时间较短的细胞（通常少于2小时），建议先加载探针，然后用活性氧自由基阳性对照物或感兴趣的药物刺激细胞；对于需要长时间刺激的细胞（通常超过6小时），建议在加载探针之前用活性氧自由基阳性对照物或感兴趣的药物刺激细胞，这里只提供后一种实验方法，步骤如下：

1. 原位加载探针（仅适用于附着细胞）

a) 细胞准备：在测试前一天放置细胞板，确保细胞数目小于5×10^5/mL。

b) 药物诱导：去除细胞培养基，加入无血清稀释药物处理细胞，在黑暗中在37°C细胞培养箱中孵育。实际诱导时间取决于药物特性和细胞类型。

c) （可选）阳性对照：用无血清培养基稀释阳性对照物H2O2，从100 mM稀释到正常工作浓度的100 μM。细胞在黑暗中孵育37°C，时间为30分钟至4小时。为了提高活性氧自由基的水平，不同细胞类型的实际时间不同。例如，HeLa细胞需要处理30-60分钟。注意：阳性对照仅在阳性对照孔中需要，其他实验组不需要。

d) 活性氧自由基探针的制备：用无血清培养基稀释DCFH-DA，最终浓度为10 μM。

e) 加载活性氧自由基探针：去除处理药物，用无血清培养基洗涤细胞1-2次，加入适量稀释的DCFH-DA工作溶液，细胞需要完全覆盖，例如6孔板通常添加不少于1 mL/孔，96孔板通常添加不少于100 μL/孔。细胞在37°C培养箱中黑暗中孵育30分钟。

f) 清洗细胞：细胞用无血清培养基洗涤1-2次，去除未进入细胞的DCFH-DA。

2. 收集细胞并加载探针（适用于附着细胞和悬浮细胞）

a) 细胞准备：按照标准方法培养细胞。需要确保用于测试的细胞状态良好。根据适当的方法清洁并收集足够数量的细胞。

b) 药物诱导：收集的细胞悬浮在适量的稀释药物中，在37°C培养箱中黑暗中孵育。实际诱导时间可以根据药物特性和细胞类型确定。

c) （可选）阳性对照：用无血清培养基稀释阳性对照物H2O2，从100 mM稀释到正常工作浓度的100 μM。细胞在黑暗中孵育37°C，时间为30分钟至4小时。为了提高活性氧自由基的水平，不同细胞类型的实际时间不同。例如，HeLa细胞需要处理30-60分钟。

d) 活性氧自由基探针的制备：用无血清培养基稀释DCFH-DA，最终浓度为10 μM。

e) 探针加载：离心收集细胞，去除处理药物，用无血清培养基洗涤细胞1-2次，再次离心收集细胞，加入稀释的探针，使细胞密度为1.0×10^6-2.0×10^7。细胞在37°C培养箱中黑暗中孵育30分钟。注意：细胞密度应根据后续的检测系统、检测方法和总检测量进行调整。例如，对于流式细胞术，单管中的细胞数目不应少于10^4且不超过10^6。

f) 清洗细胞：用无血清培养基洗涤细胞1-2次，去除未进入细胞的DCFH-DA。

3.荧光显微镜照片

a) 附着细胞（步骤1.f）可以直接在荧光显微镜下观察；对于悬浮细胞（步骤2.f），将25-50 μL细胞悬浮液滴在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖进行观察。

b) 在荧光显微镜下，使用FITC滤光片观察荧光，并去除背景以观察荧光变化。

4. 流式细胞术的操作和分析方法

a) 附着细胞（步骤1.f）用胰蛋白酶消化制备单细胞悬浮液；对于悬浮细胞（步骤2.f），直接收集细胞。细胞用0.5-1 mL PBS（0.5-1×10^5/mL）重新悬浮。

b) 在流式细胞术中，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。可以实时或定时检测刺激前后荧光强度的变化。

该试剂仅用于科学研究领域，不适用于临床诊断或其他用途。