DHE活性氧检测试剂盒：区分超氧化物与非特异性氧化的荧光方案

活性氧（ROS）是细胞氧化应激的重要介导因子，涉及信号转导、炎症、衰老及多种病理过程。准确检测ROS的产生类型和水平，对于阐明分子机制和筛选抗氧化剂至关重要。二氢乙锭（Dihydroethidium, DHE，也称hydroethidine）是一种广泛使用的氧化还原敏感性荧光探针。然而，DHE在氧化过程中可生成两种不同荧光特征的产物——超氧化物特异性氧化生成2-羟基乙锭（2-OH-E?），而非特异性ROS氧化则生成乙锭（E?）。两者的激发和发射光谱高度重叠，传统滤光片系统难以有效区分，常导致对ROS来源的误判。

由艾美捷代理的Cayman公司推出的DHE活性氧检测试剂盒（货号：601290）在经典DHE探针基础上，配套提供线粒体复合物III抑制剂Antimycin A（阳性对照）和广谱抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（抗氧化对照），帮助研究者更可靠地评估细胞或体系中的ROS生成水平。

检测原理：DHE氧化的双路径荧光特征

DHE本身为弱蓝色荧光（激发约370 nm，发射约420 nm），进入细胞后被ROS氧化形成荧光加合物。根据氧化路径不同，产物不同：

超氧化物（O???）特异性氧化：生成2-羟基乙锭（2-OH-E?），其激发峰为500–530 nm，发射峰为590–620 nm（橙红色荧光）。

其他ROS（如过氧化氢、羟自由基、过氧亚硝酸盐等）非特异性氧化：生成乙锭（E?），其激发峰约480 nm，发射峰约576 nm（橙黄色荧光）。

两者的发射光谱仅有约15–20 nm的差异，在常规的滤光片式荧光显微镜或酶标仪中极易产生串扰。因此，仅凭单个荧光通道的强度变化无法准确判断究竟是超氧化物还是总ROS升高。本试剂盒通过提供特异性阳性对照和抗氧化对照，结合合理的实验设计，帮助研究者对ROS来源进行功能性验证。

产品关键信息

项目 详细信息

别名 活性氧竞争结合分析试剂盒（基于二氢乙锭）

储存温度 -20°C

运输条件 美国大陆湿冰运输，其他地区可能有所不同

警告 仅限科研使用，不用于人体或兽医用途

试剂盒组成与对照设置

DHE探针：即用型或冻干粉，使用前溶解于适当溶剂（通常为DMSO）。

Antimycin A：线粒体电子传递链复合物III抑制剂，可诱导线粒体超氧化物产生，作为ROS生成的阳性对照。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）：广谱ROS清除剂，作为抗氧化对照，用于验证检测信号的特异性。

所需但未提供的材料

请在下载试剂盒手册后确认是否需超纯水（Milli-Q或同级）及其他组分。建议提前准备以下材料：

超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）

细胞培养相关耗材（培养板、移液器、吸头）

荧光酶标仪（配备激发480 nm/发射576 nm以及激发515 nm/发射605 nm滤光片）或流式细胞仪（配备488 nm激发激光和FL1/FL2通道）

荧光显微镜（配备FITC和TRITC滤光片组）

合适的缓冲液（如HBSS或PBS，不含酚红）

阳性对照诱导剂（试剂盒提供Antimycin A，可根据需要额外准备H?O?等）

检测流程（功能性指南）

1. 细胞准备与染色

贴壁细胞：接种于黑色透明底96孔板（荧光检测）或共聚焦培养皿（显微镜观察），培养至适宜密度（通常70–80%融合度）。

悬浮细胞：调整密度至0.5–1×10? cells/mL，转移至流式管或V底96孔板。

用无血清培养基或PBS稀释DHE探针至工作浓度（通常2–10 μM，需预实验优化）。避光操作。

加入等体积的2× DHE工作液，使终浓度为1–5 μM。37°C避光孵育30–60分钟。

染色结束后，离心（悬浮细胞）或轻柔洗涤（贴壁细胞）去除未结合的探针。

2. 实验分组与处理

建议设置以下分组，以准确解析ROS来源：

分组 处理 预期结果

阴性对照（未染色） 不加DHE，仅加溶剂 背景荧光

基础ROS组 仅加DHE 细胞基础氧化水平

阳性对照（Antimycin A） DHE + Antimycin A（终浓度1–10 μM，37°C孵育1–4小时） 超氧化物特异性增加，2-OH-E?信号升高

抗氧化对照（NAC） DHE + NAC（终浓度1–5 mM，预处理1小时） 两种ROS信号均降低

待测化合物组 DHE + 待测化合物 根据化合物性质判断ROS类型

3. 信号检测与数据分析

荧光酶标仪检测：

超氧化物（2-OH-E?）通道：激发515 nm，发射605 nm（或使用TRITC滤光片组）。

总ROS/非特异性氧化（E?）通道：激发480 nm，发射576 nm（或使用FITC滤光片组，但注意FITC通常为530 nm发射，此处576 nm接近PE通道）。

> 建议使用带宽较窄的滤光片（如±10 nm）以尽量减少通道间串扰。若无专用滤光片，可参考以下替代方案：对于2-OH-E?使用530/25 nm激发、620/20 nm发射；对于E?使用480/15 nm激发、580/15 nm发射。

流式细胞术检测：

使用488 nm激发激光。

收集FL2通道（通常在575–620 nm）的信号。由于两个产物的发射峰接近，流式细胞仪无法直接区分2-OH-E?和E?。因此，流式检测通常用于评估总ROS变化，结合阳性对照（Antimycin A诱导的信号增加）和抗氧化对照（NAC阻断）来验证特异性。

荧光显微镜检测：

使用FITC滤光片（Ex 480/Em 530）主要检测E?，但会漏检2-OH-E?部分信号。

使用TRITC滤光片（Ex 540/Em 570–625）可同时捕捉两种产物的部分信号。

定性结论：显微镜下橙红色荧光的增强主要反映超氧化物变化，但建议结合对照处理进行判断。

4. 数据解释的注意事项

由于光谱重叠，本试剂盒不能绝对定量地分离超氧化物和其他ROS。其功能优势在于：

提供标准化对照：Antimycin A已知主要诱导线粒体超氧化物，可帮助用户在自身实验体系中建立超氧化物信号变化的参考范围；NAC可验证信号是否确实来源于ROS而非探针自身氧化或非特异性结合。

趋势判断：若待测化合物引起的荧光强度变化与Antimycin A组相似（主要在TRITC通道增强），提示其可能以超氧化物为主；若变化在FITC通道更为显著，则可能涉及其他ROS类型。

互补验证：建议结合超氧化物特异性更强的探针（如MitoSOX）或使用超氧化物歧化酶（SOD）抑制实验进行交叉验证。

应用场景

线粒体功能评估：检测化合物对线粒体电子传递链的影响，判断是否诱发超氧化物泄漏。

抗氧化剂筛选：使用NAC作为阳性对照，评价待测化合物的ROS清除能力。

环境毒理学：检测污染物或纳米材料诱导细胞氧化应激的类型和程度。

药物安全性评价：早期识别候选药物的线粒体毒性风险。

储存与稳定性

试剂盒整体储存于-20°C，避免反复冻融。DHE探针对光和空气敏感，建议分装后避光保存。

Antimycin A和NAC按照说明书指定的条件储存。

运输采用湿冰条件，收货后请立即转移至-20°C。