Cell Meter 线粒体超氧化物荧光检测试剂盒：MitoROS 520 一步法活细胞定量方案

线粒体是细胞内超氧化物的主要来源。适量超氧化物的产生对于基因表达、信号转导、肌肉对耐力训练的适应等众多关键生理过程的正常调控至关重要。然而，失控的线粒体超氧化物会触发细胞氧化损伤，进而参与癌症、心血管疾病、神经退行性疾病及衰老等多种病理过程的发生发展。因此，准确检测细胞内线粒体超氧化物的水平，对于理解细胞氧化还原调控机制及其失调对各类疾病的影响具有重要价值。

由艾美捷代理cayman推出的Cell Meter? 荧光法细胞内超氧化物检测试剂盒（绿）（货号：16060）采用独特的 MitoROS? 520 超氧化物指示剂，提供了一种灵敏、一步式的荧光检测方案，可在活细胞中对线粒体超氧化物进行定量分析。仅需约 1 小时孵育，即可通过流式细胞术或荧光显微镜获得可靠结果。

检测原理

MitoROS? 520 是一种细胞通透性荧光探针，能够快速、选择性地进入活细胞并定位于线粒体。该探针本身荧光微弱，但与超氧化物特异性反应后，生成稳定的绿色荧光产物。荧光强度与线粒体内超氧化物的水平呈正比。由于该探针对超氧化物具有高度选择性，可有效避免其他活性氧（如过氧化氢、羟自由基、一氧化氮等）的干扰，从而真实反映线粒体来源的超氧化物生成情况。

产品组分与规格

本试剂盒（货号 16060）规格为 200 次检测，包含以下组分：

组分 规格 说明

组分 A：MitoROS? 520 1 瓶 超氧化物选择性荧光探针

组分 B：检测缓冲液 1 瓶（20 mL） 用于稀释探针和细胞重悬

组分 C：DMSO 1 瓶（100 ?L） 用于溶解探针

光谱特性

参数 数值

激发峰（Ex） 513 nm

发射峰（Em） 537 nm

该光谱特征与标准 FITC 通道高度匹配，无需特殊滤光片组。

仪器设置

流式细胞仪

激发光源：488 nm 激光

发射滤光片：530/30 nm（或等效 FITC 通道）

推荐通道：FL1 / FITC 通道

荧光显微镜

激发滤光片：FITC 滤光片组（约 480–500 nm 激发）

发射滤光片：FITC 滤光片组（约 515–545 nm 发射）

推荐板型：黑壁透明底微孔板（以减少孔间串扰并便于观察）

储存与安全信息

储存条件：按照各组分标签指示储存。通常探针溶解后需分装避光保存于 -20°C，避免反复冻融。检测缓冲液可冷藏（4°C）保存。

危险标识：XN（有害）

H 语句：H303（吞食可能有害）、H313（皮肤接触可能有害）、H333（吸入可能有害）

R 语句：R20（吸入有害）、R21（皮肤接触有害）、R22（吞食有害）

预期用途：仅限科研使用（Research Use Only, RUO）

> 安全提示：操作时应穿戴实验服、手套和护目镜，在通风良好的环境中进行。

实验设计建议

分组 处理 目的

空白对照 不加探针（仅缓冲液） 扣除细胞自发荧光背景

阴性对照 加探针，不加诱导剂 细胞基础线粒体超氧化物水平

阳性对照 加探针 + 超氧化物诱导剂 验证体系响应性，确定最大信号

待测物组 加探针 + 待测化合物 评估化合物对线粒体超氧化物的影响

抑制组 预先加抗氧化剂 + 探针 + 诱导剂 确认信号来源于超氧化物

注意事项

1. 避光操作：MitoROS? 520 对光敏感，探针配制和细胞孵育全过程需严格避光。

2. 无血清条件：推荐在无血清培养基或检测缓冲液中进行探针加载，因为血清中的成分可能降解探针或增加背景荧光。

3. 探针浓度优化：不同细胞系对探针的摄取效率不同，建议进行浓度梯度预实验（如 1 μM、2.5 μM、5 μM），以获得最佳信噪比。

4. 孵育时间：30–60 分钟通常足够，但若信号较弱可延长至 90 分钟。长时间孵育可能导致探针非特异性氧化，需设置时间梯度对照。

5. 阳性对照的选择：经典线粒体超氧化物诱导剂包括抗霉素 A（复合物 III 抑制剂）和鱼藤酮（复合物 I 抑制剂）。使用浓度需根据细胞类型预实验确定（例如抗霉素 A 常用 1–10 μM，处理 1–4 小时）。

6. 贴壁细胞消化：若使用流式细胞术检测贴壁细胞，需在探针加载后用不含 EDTA 的胰酶消化（EDTA 可能淬灭荧光或影响细胞活力）。消化后立即中和并重悬于检测缓冲液中上机。

7. 时间一致性：从探针加载完成到检测之间的时间应尽可能保持一致（例如均在 30 分钟内完成），以减少因探针自发氧化或光漂白带来的变异。

产品优势总结

线粒体靶向特异性：MitoROS? 520 选择性定位于线粒体，直接反映线粒体超氧化物水平，而非细胞质总 ROS。

高选择性：对超氧化物的响应特异性优于普通 ROS 探针（如 DCFH-DA 可被多种 ROS 氧化），减少假阳性干扰。

一步法操作：仅需将探针与细胞混合孵育，无需裂解、洗涤或多步反应，细胞损伤小，适用于活细胞动态监测。

快速检测：1 小时孵育即可获得可靠信号，适合高通量筛选和药物时间效应研究。

平台兼容性强：光谱与 FITC 通道完美匹配，可直接使用常规流式细胞仪和荧光显微镜，无需购置特殊滤光片。

应用场景

线粒体功能评估：检测化合物或基因干预对线粒体超氧化物生成的影响。

抗氧化剂筛选：评价候选化合物清除线粒体超氧化物的能力。

疾病机制研究：探究心血管疾病、神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）、衰老及糖尿病中线粒体氧化应激的角色。

药物安全性评价：早期识别具有线粒体毒性风险的候选药物。

运动生理学：研究耐力训练中肌肉线粒体超氧化物信号通路的适应性变化。

文献参考（部分）：

Mitochondrial flashes: dump superoxide and dance with protons now

Authors: Demaurex N, Schwarzl and er M., undefined

Journal: Antioxid Redox Signal. (2016)

Up-Regulation of Mitochondrial Antioxidant Superoxide Dismutase Underpins Persistent Cardiac Nutritional-Preconditioning by Long Chain n-3 Polyunsaturated Fatty Acids in the Rat

Authors: Abdukeyum GG, Owen AJ, Larkin TA, McLennan PL.

Journal: J Clin Med (2016): 32

Expression and polymorphism (rs4880) of mitochondrial superoxide dismutase (SOD2) and asparaginase induced hepatotoxicity in adult patients with acute lymphoblastic leukemia

Authors: Alachkar H, Fulton N, Sanford B, Malnassy G, Mutonga M, Larson RA, Bloomfield CD, Marcucci G, Nakamura Y, Stock W.

Journal: Pharmacogenomics J. (2016)