SPY555-肌动蛋白探针，明亮且无毒，适用于活细胞和固定细胞

SPY555-actin 是一种基于我们 SPY? 系列染料的明亮且无毒的 F-肌动蛋白染料，适用于活细胞和固定细胞。其优化的结构能够快速标记活细胞和固定细胞中的 F-肌动蛋白，具有高特异性和极低背景。SPY555-actin 可以在无需遗传操作或荧光蛋白过表达的情况下，对活细胞或固定细胞的 F-肌动蛋白进行染色。它的吸收光谱和发射光谱与四甲基罗丹明（TMR）相似。SPY555-actin 可以与 SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR 和 GFP 进行多色成像。它可以使用标准的 TMR 或 Cy3 滤光片组进行成像，并可用于活细胞或固定细胞和组织的宽场、共聚焦、SIM 或 STED 成像。包含一瓶 SPY555-actin（冻干品）。

艾美捷SPY555-肌动蛋白探针（#CY-SC202）特性：

吸收峰（λabs）：555 nm  

荧光峰（λfl）：580 nm  

是否适用于固定细胞：是，适用于甲醛固定的细胞  

探针数量：100 次染色

荧光寿命：2.4 ns  

STED 消耗波长：660 nm 或 775 nm  

运输条件：室温  

储存条件：-20°C  

储存与操作  

收到后请将探针保存在 -20°C 或以下。冻干探针在室温下可稳定保存超过 1 周，在 -20°C 下可稳定保存超过 12 个月。使用无水 DMSO 复溶 SPY555-actin。我们建议使用新开封的无水 DMSO 来制备 1000×储备液。DMSO 与空气和水分接触会产生降解产物，这会显著缩短探针在溶液中的保质期，即使在 -20°C 下也是如此。使用后，请将 1000×储备液保存在 -20°C 或以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，1000×储备液可稳定保存 3 个月。注意：DMSO 溶液应特别小心处理，因为 DMSO 已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。

图：用共聚焦显微镜与STED显微镜成像的SPY标记的HeLa细胞的比较。使用93X物镜拍摄，由Spirochome提供。

标记协议  

注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的 HeLa 细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。本协议中的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SPY555-actin 基于选择性 F-肌动蛋白配体雅斯普霉素的衍生物。在高剂量下，它可能会改变活细胞中的肌动蛋白代谢。因此，如果计划进行长期（>12 小时）成像实验，建议使用 1000 倍或更高倍数稀释的 SPY555-actin。对于所有其他用途，建议使用 1000 倍稀释的 SPY555-actin 进行染色。

1. 配制 1000×储备液  

向 SPY555-actin 小瓶中加入 50 ?L 无水 DMSO，制备 1000×储备液。我们建议使用新开封的无水 DMSO 来制备 1000×储备液。DMSO 与空气和水分接触会产生降解产物，这会显著缩短探针在溶液中的保质期，即使在 -20°C 下也是如此。此时，溶液可能会有颜色，但这不会影响探针的性能。使用后，应将该溶液保存在 -20°C 或以下。不要将 1000×储备液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该探针不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液可稳定保存 3 个月。

2. 配制染色液  

将 SPY555-actin 稀释到 1×浓度，加入常用的细胞培养基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暂涡旋。如果不能一次完成稀释，请使用 DMSO 制备中间稀释液，因为使用水性缓冲液制备中间稀释液会导致探针聚集。快速进行下一步。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用 1000 倍稀释液进行染色，然后在后续实验中优化 SPY555-actin 的稀释倍数，直至达到最佳染色效果。仅使用新配制的染色液，不要重复使用。

3. 细胞准备与染色  

按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用步骤 2 新鲜配制的染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于 37°C、含 5% CO? 的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系。

4. 细胞成像  

SPY555-actin 的成像最好使用标准的 TMR 或 Cy3 设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针保留在成像介质中，以获得稳定的信号。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。   

基于以下条件：每次染色实验使用 0.5 mL 1×探针浓度的染色液。通过减少体积或探针浓度，可以进一步增加染色实验的次数。  

标记时间是针对 HeLa 细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。