PAK磁珠,Rac1/Cdc42结合域蛋白磁珠纯度测定&储存方案

人类 p21 活化激酶 1 蛋白（PAK）的 Rac/Cdc42 结合域已被过表达为带有 GST 标签的重组蛋白，并在细菌表达系统中与颜色编码的谷胱甘肽琼脂糖珠子结合。重组蛋白（氨基酸 67-150）包括高度保守的 PBD 区域（也称为 CRIB 区域）以及与 GTP-Rac 和 GTP-Cdc42 蛋白高亲和力相互作用所需的序列。重组蛋白在其氨基末端带有 GST 标签（28 kDa），其近似分子量为 34 kDa。PAK-GST 蛋白珠子（每管含 500 ?g 蛋白）以紫色冻干粉形式提供。一管 PAK02 应足以进行大约 25 次测定。

艾美捷PAK磁珠,Rac1/Cdc42结合域蛋白磁珠（#PAK02-A）生物学活性测定：

PAK-GST 蛋白能够特异性识别并结合 Rac 和 Cdc42 蛋白的活性“GTP 结合”形式（1），而对 Rac 和 Cdc42 的非活性“GDP 结合”形式亲和力较低。当与颜色编码的谷胱甘肽琼脂糖基质结合时，PAK-GST 蛋白珠子成为检测 Rac 和 Cdc42 蛋白活性的便捷工具。PAK-GST 蛋白珠子的标准生物学测定包括从加载了 GTPγS 或 GDP 的人血小板提取物中拉下 Rac 蛋白。

图 1：PAK-GST 蛋白珠子纯度测定  

将 20 ?g 的 PAK-GST 蛋白珠子样本（分子量约为 34 kDa）通过 12% SDS-PAGE 系统进行电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。蛋白定量采用 Precision Red 蛋白测定试剂（货号：ADV02）进行。Mark12 分子量标记来自 Invitrogen。

图 2：PAK-GST 蛋白珠子在体外对 Rac1 的 GTP 结合形式的特异性结合  

将 120 ?g 脑提取物加载 GTPγS（泳道 2）或 GDP（泳道 3），如方法所述。然后将提取物与 20 ?g 的 PAK-GST 蛋白珠子孵育。通过离心回收蛋白-珠子复合物，并使用针对 Rac1 的特异性单克隆抗体进行 Western blot 分析。泳道 1 显示 50 ng 的重组 His-Rac1 对照蛋白（注意：由于存在 6×His 标签，His-Rac1 的泳动位置略高于内源性 Rac）。SeeBlue 分子量标记来自 Invitrogen。

储存与复溶

短暂离心以使产品聚集在管底。每管蛋白结合珠子应通过加入 500 ?L 蒸馏水复溶至 1 mg/ml。复溶后，蛋白-珠子将处于以下缓冲液中：50 mM Tris，pH 7.5，50 mM NaCl，2.0%（质量/体积）葡聚糖和 10%（质量/体积）蔗糖。蛋白-珠子基质将呈现紫色，便于检测。储存时，应将颜色编码的珠子悬浮液分装成实验用量大小，在液氮中快速冷冻并保存在 -70°C。在此条件下，蛋白珠子可稳定保存 6 个月。我们推荐每次实验测定使用 20 ?l 的分装量（20 ?g 蛋白）（见本协议中的生物学活性测定）。为保持高生物学活性，蛋白-珠子悬浮液不应多次经历冻融循环。如果在 4°C 下干燥保存至<10%湿度，冻干蛋白珠子可稳定保存 1 年。

纯度

通过扫描密度法对 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上考马斯亮蓝染色的蛋白进行分析，确定蛋白纯度。PAK-GST 蛋白珠子的纯度被确定为 88%（见图 1）。

试剂

1. PAK-GST 蛋白珠子（货号：PAK02）  

2. 上样缓冲液（150 mM EDTA）  

3. 停止缓冲液（600 mM MgCl?）  

4. 洗涤缓冲液（25 mM Tris，pH 7.5，30 mM MgCl?，40 mM NaCl）  

5. 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，10 mM MgCl?，0.3 M NaCl，2% IGEPAL）  

6. GTPγS（20 mM 溶液）  

7. GDP（100 mM 溶液）  

8. 牛脑或猪脑提取物（20 mg/ml），在 50 mM PIPES，pH 7.0，130 mM NaCl，1 mM PMSF，1 mM DTT，5 ?g/ml 胰蛋白酶抑制剂，0.5% Triton X-100 中制备  

9. 蛋白酶抑制剂混合液（货号：PIC02）  

10. 抗 Rac1 单克隆抗体（货号：ARC03）  

设备

1. 4°C 微型离心机  

2. SDS-PAGE 和 Western blot 装置  

文献参考：

1. Manser, E. et al. 1994. Nature. 367: 40-46.