BPS Bioscience Notch1/CSL 荧光素酶报告基因 HEK293 细胞系，发育生物学与癌症研究

Notch1/CSL荧光素酶报告基因HEK293细胞系是一种HEK293细胞系，表达由Notch反应元件（CSL反应元件）控制的萤火虫荧光素酶报告基因，以及表达Notch1ΔE（整个细胞外结构域被删除的Notch1）。在细胞内，Notch1ΔE可以被γ-分泌酶切割。这种活跃的Notch1 NICD（Notch细胞内结构域）转移到细胞核并诱导荧光素酶报告基因的表达。该细胞系已通过使用已知的Notch信号通路抑制剂来验证荧光素酶报告基因表达的抑制。

背景：

Notch信号通路控制脊椎动物和无脊椎动物组织中的细胞命运决定，并参与胚胎发育、组织稳态以及免疫和血管生成系统的调节。Notch信号通过与存在于相对细胞中的跨膜配体结合到四个现有的Notch跨膜受体之一（Notch1/Notch2/Notch3/Notch4）来触发。这导致Notch受体的蛋白水解切割，释放Notch受体的恒定活跃的细胞内结构域（NICD）。NICD转移到细胞核，并与转录因子CSL（CBF1/RBPJκ/无毛抑制因子/Lag-1）和共激活因子Mastermind结合，启动Notch反应基因的转录。Notch信号的功能障碍有严重后果，包括发育病理或癌症（如T细胞急性淋巴细胞性白血病、T-ALL和尿路上皮膀胱癌）。作为癌症治疗选项以及在组织再生中使用Notch抑制剂，主要是γ-分泌酶抑制剂，正在进行中。进一步的研究将使我们更深入地理解Notch信号，并有利于未来的治疗途径。

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应用：

- 监测Notch信号通路活性。

- 在细胞模型中筛选Notch信号通路的抑制剂。

细胞培养协议：

细胞解冻：

1. 从液氮存储中取出一个细胞瓶。在准备好解冻之前，将其保存在干冰上。

2. 准备好解冻时，在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。一旦细胞解冻（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶中的全部内容转移到一个空的50毫升锥形管中。

注意：在37°C水浴中放置细胞太久会导致活性迅速丧失。

3. 使用10毫升的血清学移液管，慢慢地向含有细胞的锥形管中加入10毫升预热的解冻培养基1。解冻培养基1应该滴加，同时轻轻摇晃锥形管，以实现温和混合，避免渗透冲击。

4. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在5毫升预热的解冻培养基1中重悬细胞。

5. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

6. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基1，并在37°C、5% CO2培养箱中继续培养，直到细胞准备好分裂。

7. 细胞应在完全融合前分裂。在第一次传代及后续传代中，使用生长培养基1A。

细胞传代：

1. 抽吸培养基，用无Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05% Trypsin/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1A并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在生长培养基1A中重悬细胞。

4. 按照推荐的次培养比例1:10每周一次或两次将细胞种植到新的培养容器中。

细胞冷冻：

1. 抽吸培养基，用无Ca2+/Mg2+的PBS冲洗细胞，并用0.05% Trypsin/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1A并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬细胞，细胞浓度约为2 x 10^6细胞/ml。

4. 将1毫升的细胞悬浮液分装到每个冷冻瓶中。将瓶子放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜保存。

5. 次日将瓶子转移到液氮中进行长期存储。

注意：建议扩展细胞并在早期传代时至少冷冻10瓶细胞以备将来使用。

图1：Notch1/CSL荧光素酶报告基因HEK293细胞系对DAPT（一种Notch通路抑制剂）的响应。

DAPT抑制Notch1/CSL荧光素酶报告基因HEK293细胞中荧光素酶的表达。CSL报告基因HEK293细胞用作对照。CSL报告基因HEK293细胞系包含由Notch反应元件（CSL反应元件）控制的萤火虫荧光素酶报告基因，但不表达Notch1ΔE，因此无法表达Notch荧光素酶报告基因。活性使用ONE-Step?荧光素酶检测系统进行测量。

文献参考：

1. Lu F.M., et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(11): 5663-5667.

2. Kanungo J., et al., 2008 J. Neurochem. 106: 2236-48.

3. Cao L. et al., 2023 Blood Adv. 10.1182/bloodadvances.2023010380

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