RhoA Pull-down激活检测试剂盒，从裂解到WB全流程覆盖

背景概述

Rho家族小GTP酶包含至少20个成员，其中Rac1、RhoA和Cdc42是研究最为深入的三种蛋白。与所有小G蛋白一样，Rho蛋白作为分子开关，通过一系列效应蛋白传递细胞信号。该家族介导多种细胞响应，包括细胞骨架重组、转录调控、DNA合成、膜运输及细胞凋亡。Rho开关通过在活性GTP结合状态与非活性GDP结合状态之间交替来发挥作用。理解GTP酶激活/失活调控机制具有重要的生物学意义，也是当前研究的热点领域。Rho家族效应蛋白特异性识别GTP结合形式蛋白这一特性，已被实验性地用于开发监测Rho蛋白激活的亲和纯化检测方法。

检测原理

本检测采用Rho效应蛋白rhotekin的Rho结合结构域（RBD）。RBD蛋白基序已被证实可特异性结合Rho的GTP结合形式。rhotekin的RBD区域对GTP-Rho具有高亲和力，使其成为从细胞裂解液中亲和纯化GTP-Rho的理想工具。本试剂盒提供的rhotekin-RBD蛋白包含rhotekin RBD的第7–89位氨基酸，以GST融合形式在大肠杆菌中表达，并偶联至彩色谷胱甘肽-琼脂糖珠上。这使得研究者可通过“pull-down”方式捕获与rhotekin-RBD珠结合的GTP-Rho复合物。该检测为分析多种系统中的细胞Rho活性提供了简便手段。活化Rho的量通过使用Rho特异性抗体的Western blot进行测定。

应用场景

由艾美捷代理Cytoskeleton推出的RhoA Pull-down激活检测试剂盒（珠式pull-down格式）（货号BK036）适用于检测细胞和组织裂解液中被激活（GTP结合型）的RhoA蛋白，以及研究RhoA信号通路。对于需要直接、经典方式评估RhoA活性的实验体系，本试剂盒提供了成熟可靠的解决方案。

试剂盒组成

试剂盒提供20–80次检测所需组分，主要包括：用于亲和纯化活性RhoA、B和C的Rhotekin-PBD珠；仅用于检测活化RhoA的RhoA特异性抗体；His-RhoA对照蛋白；针对维持GTP结合型Ras优化的细胞裂解缓冲液与洗涤缓冲液；用于对照反应的加载缓冲液、STOP缓冲液、GTPγS及GDP；蛋白酶抑制剂混合物；用于蛋白酶重悬的DMSO。

所需设备与材料

用户需自备细胞裂解液、细胞刮刀、液氮（用于速冻裂解液）、Western blot所需设备及分析系统、微量离心机。

检测流程与关键特性

RhoA pull-down检测通过固定于琼脂糖珠上的效应蛋白RhoA/B/C结合结构域（RBD）分离活性RhoA（GTP结合型），随后使用RhoA特异性抗体通过Western blot对结合的RhoA进行检测和定量。

关键特性如下：本检测为半定量检测；检测灵敏度为1 ng活化RhoA；检测特异性针对RhoA；每次检测需200 ?g至1 mg细胞或组织裂解液；整个流程约需10小时，通常分两天完成。

功能优势与注意事项

本试剂盒的核心优势在于采用经典pull-down原理，通过rhotekin-RBD对GTP-Rho的高亲和力实现活性RhoA的特异性捕获，配合RhoA特异性抗体确保检测特异性。试剂盒内置GTPγS与GDP对照体系，便于验证实验有效性。需注意的是，本检测为半定量且样本输入量较大、流程时间较长，适合对通量要求不高但需要直接评估RhoA活性的研究场景。对于裂解液有限或需要定量结果的实验，可考虑G-LISA格式试剂盒作为替代方案。

文献参考

1. Ridley, A.J. & Hall, A. 1992. The small GTP-binding protein Rho regulates the assemblyof focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70, 389-399.

2. Ridley, A.J. et al. 1992. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factorinduced membrane ruffling. Cell. 70, 401-410.

3. Nobes, C.D. et al. 1995. Rho, Rac, and Cdc42 GTPases regulate the assembly ofmultimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, andfilopodia. Cell. 81, 53-62.

4. Waterman-Storer, C.M. et al. 1999. Microtubule growth activates Rac1 to promotelamellipodial protrusion in fibroblasts. Nature Cell Biol. 1, 45-50.

5. Hill, C.S. et al. 1995. The Rho family GTPases RhoA, Rac1, and Cdc42Hs regulatetranscriptional activation by SRF. Cell. 81, 1159-1170.