Rac1 Pull-down激活检测试剂盒-共激活样本中精准区分Rac1，排除Cdc42干扰

背景概述

Rho家族小GTP酶包含至少20个成员，其中Rac1、RhoA和Cdc42是研究最为深入的三种蛋白。与所有小G蛋白一样，Rho家族蛋白作为分子开关，通过一系列效应蛋白传递细胞信号。该家族介导多种细胞响应，包括细胞骨架重组、转录调控、DNA合成、膜运输及细胞凋亡。Rho家族开关通过在活性GTP结合状态与非活性GDP结合状态之间交替来发挥作用。理解GTP酶激活/失活调控机制具有重要的生物学意义，也是当前研究的热点领域。Rho家族效应蛋白特异性识别GTP结合形式蛋白这一特性，已被实验性地用于开发监测Rac1和Cdc42蛋白激活的亲和纯化检测方法。

检测原理

本检测采用P21活化激酶1（PAK）的Rac/Cdc42结合结构域（PBD）。该PBD蛋白基序对GTP结合形式的Rac和Cdc42具有高亲和力，偶联至琼脂糖珠后，可从细胞裂解液中特异性捕获活性形式的Rac/Cdc42。随后使用Rac1特异性抗体通过Western blot对结合的Rac1进行检测和定量。由于PAK-PBD可同时结合Rac与Cdc42，而检测抗体针对Rac1特异性识别，因此本试剂盒可在Rac1与Cdc42共激活的样本中实现Rac1的选择性检测。

应用场景

由艾美捷代理Cytoskeleton推出的Rac1 Pull-down激活检测试剂盒（珠式pull-down格式）（货号BK035）适用于检测细胞和组织裂解液中被激活（GTP结合型）的Rac1蛋白，以及研究Rac1信号通路。对于需要直接、经典方式评估Rac1活性的实验体系，本试剂盒提供了成熟可靠的解决方案。

试剂盒组成

试剂盒提供20–50次检测所需组分，主要包括：用于亲和纯化活性Rac与Cdc42的PAK-PBD珠；仅用于检测活化Rac1的Rac1特异性抗体；His-Rac1对照蛋白；针对维持GTP结合型Ras优化的细胞裂解缓冲液与洗涤缓冲液；用于对照反应的加载缓冲液、STOP缓冲液、GTPγS及GDP；蛋白酶抑制剂混合物；用于蛋白酶重悬的DMSO。

所需设备与材料

用户需自备细胞裂解液、细胞刮刀、液氮（用于速冻裂解液）、Western blot所需设备及分析系统、微量离心机。

检测流程与关键特性

Rac1 pull-down检测通过固定于琼脂糖珠上的效应蛋白Rac/Cdc42结合结构域（PBD）分离活性Rac/Cdc42（GTP结合型），随后使用Rac1特异性抗体通过Western blot对结合的Rac1进行检测和定量。

关键特性如下：本检测为半定量检测；检测灵敏度为1 ng活化Rac1；检测特异性针对Rac1；每次检测需200 ?g至1 mg细胞或组织裂解液；整个流程约需10小时，通常分两天完成。

功能优势与注意事项

本试剂盒的核心优势在于采用经典pull-down原理，通过PAK-PBD对GTP-Rac/Cdc42的高亲和力实现活性Rac1的特异性捕获，配合Rac1特异性抗体确保在Rac与Cdc42共激活样本中的选择性检测。试剂盒内置GTPγS与GDP对照体系，便于验证实验有效性。需注意的是，本检测为半定量且样本输入量较大、流程时间较长，适合对通量要求不高但需要直接评估Rac1活性的研究场景。对于裂解液有限或需要定量结果的实验，可考虑G-LISA格式试剂盒作为替代方案。

文献参考

1. Ridley, A.J. & Hall, A. 1992. The small GTP-binding protein Rho regulates the assemblyof focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70, 389-399.

2. Ridley, A.J. et al. 1992. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factorinduced membrane ruffling. Cell. 70, 401-410.

3. Nobes, C.D. et al. 1995. Rho, Rac, and Cdc42 GTPases regulate the assembly ofmultimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, andfilopodia. Cell. 81, 53-62.

4. Waterman-Storer, C.M. et al. 1999. Microtubule growth activates Rac1 to promotelamellipodial protrusion in fibroblasts. Nature Cell Biol. 1, 45-50