兔抗RAP80抗体亲和纯化，灵敏检测内源性RAP80表达

一、产品概述

RAP80（受体相关蛋白80，又称UIMC1）是一种核蛋白，最早被鉴定为与视黄酸相关睾丸受体（RTR）相互作用并抑制其与共抑制因子N-CoR的结合。后续研究表明，RAP80还能与雌激素受体α（ER-α）相互作用，通过其泛素相互作用基序（UIM）调控ER-α的转录活性。更重要的是，RAP80的UIM在BRCA1依赖性DNA损伤修复应答中发挥关键作用。本文介绍一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的针对人RAP80蛋白中部区域（第600至650位氨基酸）的兔多克隆抗体（货号：A300-763A）。该抗体经抗原亲和纯化，以未标记完整IgG形式提供，浓度1000 ?g/ml，适用于免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB）检测，反应性为人源样本。

二、核心规格参数

参数 | 详细信息

靶标 | RAP80 / UIMC1

反应性 | 人

应用 | IP， WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第600至650位氨基酸

亚型 | IgG

标记 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原物种 | 人

浓度 | 1000 ?g/ml

储存温度 | 2 – 8 °C

有效期 | 自收货之日起1年

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸盐缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮化钠

三、免疫原与表位定位

本抗体的免疫原对应人RAP80蛋白（UniProt ID: Q96RL1）第600至650位氨基酸之间的区域。参考序列登录号为NP_057374.3，对应GeneID 51720（基因符号UIMC1）。该区域位于RAP80的C端部分，介于两个泛素相互作用基序（UIM）与C端结构域之间。选择这一表位有助于特异识别全长RAP80，同时避免与含有UIM的其他蛋白（如其他泛素结合蛋白）发生交叉反应。

四、生产与亲和纯化工艺

抗体采用固相载体上固定的RAP80特异性表位（第600-650位）进行亲和纯化。将该合成肽段偶联至亲和基质，兔抗血清经亲和柱层析后获得高纯度、高特异性的多克隆抗体。免疫球蛋白浓度依据比尔定律测定：1 mg/ml IgG在280 nm波长处的吸光度为1.4。纯化后抗体浓度为1000 ?g/ml，保存在Tris-柠檬酸/磷酸盐缓冲液（pH 7-8）中，并添加0.09%叠氮化钠作为防腐剂。

五、储存与稳定性

抗体应在2°C至8°C条件下储存，切勿冷冻。自收货之日起，在推荐的储存条件下有效期为1年。缓冲液中的叠氮化钠会抑制过氧化物酶活性，若后续实验需进行HRP标记（如直接标记本抗体），需通过透析或脱盐去除叠氮化钠。对于常规WB和IP实验（本抗体作为一抗，配合二抗使用），一般无需处理。

六、应用指南与优化参数

以下稀释度和操作条件基于产品验证数据提供。所有蛋白质印迹实验均使用含5%脱脂奶粉的TBST作为封闭液及抗体稀释液，一抗孵育条件为4°C过夜。对于不同实验类型，需根据样本性质选择适当的二抗。

免疫沉淀（IP）

推荐用量：6 ?g 抗体 / mg 细胞裂解物总蛋白

操作流程要点：

1. 制备细胞裂解液：推荐使用非变性裂解缓冲液（如含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解液或RIPA缓冲液）。RIPA可能破坏某些蛋白相互作用，若需保留RAP80与BRCA1或其他修复蛋白的复合物，建议使用温和裂解液（如20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA）。

2. 取1 mg总蛋白裂解液，加入6 ?g本抗体。

3. 4°C旋转孵育过夜，确保抗原-抗体充分结合。

4. 加入蛋白A琼脂糖或磁珠（根据抗体宿主选择兔特异性介质），继续孵育2-4小时。

5. 用裂解液洗涤沉淀复合物3-5次。

6. 加入SDS-PAGE上样缓冲液（含还原剂），煮沸5分钟洗脱。

7. Western blot检测：洗脱产物进行WB时，必须使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（而非识别重链的二抗），并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清（货号S100-020），以避免免疫沉淀中抗体重链（约55 kDa）与RAP80（约80 kDa）信号重叠。

蛋白质印迹（WB）

推荐稀释度：1:1,000 – 1:10,000

通用操作条件：

封闭液及抗体稀释液：5%脱脂奶粉-TBST（含0.1% Tween-20的TBS）。

一抗孵育：4°C过夜（推荐）。

二抗使用：

细胞裂解液WB：使用常规山羊抗兔IgG（识别重链和轻链，货号A120-101P）。

免疫沉淀后WB：必须使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，并在封闭液中添加5%正常猪血清（见上文IP部分）。

检测：ECL化学发光检测。

蛋白大小：RAP80的表观分子量约为80 kDa。建议同时上样阳性对照裂解液（如HeLa、293T、MCF-7细胞裂解液）以及预染分子量标记。在还原条件下，RAP80迁移速度接近80 kDa标记。

注意：由于RAP80参与DNA损伤应答，使用DNA损伤剂（如喜树碱、依托泊苷、电离辐射）处理细胞后，RAP80会被招募到DNA损伤位点，但其总蛋白水平通常不变。WB检测时需注意样本处理的一致性。