兔抗PHLPPL抗体亲和纯化，IP/WB双平台验证，精准检测Akt调控因子

一、产品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗PHLPPL抗体亲和纯化抗体，货号：A300-661A是一款以兔为宿主来源、针对人PHLPPL蛋白的多克隆抗体。该抗体采用抗原亲和纯化工艺制备，以完整IgG形式提供，浓度为200 ?g/ml，未偶联任何标记物，适用于免疫沉淀及免疫印迹实验。抗体同时识别小鼠和人类来源的PHLPPL，具有跨物种反应性，是Akt信号通路研究中重要的检测工具。

二、靶点信息：PHLPPL / PHLPP2

PHLPPL（PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase-like），亦称PHLPP2，属于PH结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶家族。该蛋白的核心功能是去磷酸化并失活Akt——Akt是调控细胞存活与凋亡平衡的关键信号分子。通过使Akt去磷酸化，PHLPPL可触发细胞凋亡并抑制肿瘤细胞生长。

PHLPPL与PHLPP1功能相似，两者协同作用，通过靶向特定的Akt亚型选择性终止Akt信号通路。PHLPPL也被称为PHLPP2或PPM3B（蛋白磷酸酶，Mg??/Mn??依赖性3B）。

三、免疫原与特异性

本抗体识别的表位位于人PHLPPL蛋白第1275位至C末端（第1323位）区域之间（参考序列NP_055835.2，GeneID 23035）。具体免疫原设计针对1273至C末端区域，该区域对应蛋白的C末端结构域。

抗体采用固相载体上固定的表位特异性肽段进行亲和纯化，确保对PHLPPL的高特异性识别，避免与PHLPP1或其他含PH结构域或亮氨酸重复序列的蛋白发生交叉反应。

四、产品规格与储存

参数 | 详情

靶点 | PHLPPL / PHLPP2

反应性 | 小鼠、人

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形态 | 全IgG

亚型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人

浓度 | 200 ?g/ml

缓冲液 | 含0.1% BSA及0.09%叠氮钠的Tris缓冲盐水

储存条件 | 2–8°C

有效期 | 自收货起1年

浓度测定：采用比尔定律测定免疫球蛋白浓度，其中1 mg/ml IgG在280 nm波长的吸光度为1.4。

五、应用与推荐稀释度

应用 | 推荐用量/稀释度 | 备注

免疫沉淀 | 6 ?g/mg 裂解物 | 每毫克总蛋白使用6 ?g抗体

免疫印迹 | 1:2000 – 1:10,000 | 推荐起始稀释度1:2000

六、免疫印迹操作要点

通用条件：

封闭液及抗体稀释液：5% Milk-TBST（不可使用BSA，牛奶封闭效果更佳）

一抗孵育：过夜（overnight），推荐4°C或室温

细胞裂解液WB检测：

二抗推荐：山羊抗兔IgG重轻链抗体（A120-101P）

免疫沉淀产物WB检测：

二抗推荐：抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（避免重链干扰）

封闭缓冲液添加：5%正常猪血清（货号S100-020），以降低非特异性背景

七、技术要点与优化建议

1. 目标蛋白分子量与凝胶选择

PHLPPL/PHLPP2的分子量约为132–140 kDa（基于氨基酸序列）。在WB检测中：

推荐使用6-8% SDS-PAGE凝胶或4-12%梯度胶

转移条件：湿转建议300 mA恒流2-3小时，或4°C过夜

可使用PVDF膜或NC膜，PVDF结合力更高

2. 免疫沉淀的关键优化

抗体用量：6 ?g/mg总蛋白裂解物是经验证的标准用量。若蛋白表达量低，可适当增加至8-10 ?g/mg。

裂解液选择：推荐使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS），可有效释放核及细胞质蛋白。

裂解物浓度：建议使用1-2 mg总蛋白进行IP，确保目标蛋白丰度。

洗涤严格性：使用含0.1% Tween-20的TBS或PBS洗涤3-5次，每次5分钟，以降低非特异性条带。

3. 二抗选择的关键考量

在检测IP产物的WB时，常规抗兔IgG二抗会同时识别抗体的重链（~55 kDa）和轻链（~25 kDa）。由于PHLPPL分子量为132-140 kDa，远大于重链和轻链，重链信号不会直接干扰目标条带。但若实验涉及近分子量（50-60 kDa）的目标蛋白，则必须使用轻链特异性二抗以避免干扰。本产品信息仍建议IP-WB中使用轻链HRP二抗，以降低背景，提高信噪比。

4. 叠氮钠的注意事项

缓冲液中含有0.09%叠氮钠作为防腐剂。如计划对抗体进行偶联标记（如生物素或HRP），需注意叠氮钠会抑制标记反应，建议使用前通过透析或脱盐去除。