兔抗KIAA0310抗体亲和纯化，高分子量蛋白检测专用解决方案

一、产品概述

本文介绍一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的针对人KIAA0310（即SEC16A）的兔多克隆抗体（货号：A300-648A）。该抗体特异性识别KIAA0310蛋白第775–825位氨基酸之间的区域（表位实际映射至第600–650位），经抗原亲和纯化后以完整IgG形式提供，未偶联标记物。已验证反应种属为人，推荐应用于免疫沉淀（IP）及免疫印迹（WB）。

KIAA0310是在Kazusa cDNA测序项目中通过生物信息学预测的假设蛋白，后续研究证实其为人类SEC16A同源物。在芽殖酵母中，Sec16是定位于内质网膜的蛋白，通过与COPII囊泡包被复合物相互作用参与蛋白质从内质网向高尔基体的运输。SEC16A在哺乳动物细胞中同样作为内质网输出位点（ERES）的组织者，对COPII介导的分泌通路至关重要。可靠的特异性抗体对于研究分泌途径、内质网应激响应及囊泡运输调控具有重要价值。

二、详细规格参数

参数 | 信息

靶标 | KIAA0310（SEC16A）

反应种属 | 人

应用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第775–825位氨基酸之间的区域

亚型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

免疫原种属 | 人

浓度 | 200 ?g/ml

存储条件 | 2–8 °C

有效期 | 收货后1年

缓冲液 | Tris缓冲盐水，含0.1% BSA及0.09%叠氮化钠

浓度说明：本产品浓度为200 ?g/ml，不同于常规1000 ?g/ml产品。使用时需根据此浓度换算抗体体积。

三、抗原表位与生产信息

该抗体识别的人KIAA0310表位位于第600–650残基之间（参考序列号O15027，GeneID 9919）。免疫原设计对应第775–825区域，但亲和纯化及验证所用表位为第600–650区间。这一差异不影响产品性能，用户可依据已确认的表位区域（600–650）进行实验设计。

纯化工艺采用固相载体固定的表位特异性亲和层析，仅富集针对该区域的高亲和力IgG分子。缓冲液中含有0.1% BSA作为载体蛋白，有助于低浓度（200 ?g/ml）下抗体的稳定性，减少管壁吸附。

免疫球蛋白浓度通过比尔定律测定（1 mg/mL IgG在A280处的吸光度为1.4）。

四、应用方法与推荐条件

4.1 免疫印迹（WB）

推荐稀释比：1:2,000 至 1:10,000

通用条件：

封闭液及抗体稀释液：含5%脱脂牛奶的TBST

一抗孵育：4°C过夜

细胞裂解液WB二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）HRP抗体（货号A120-101P）

免疫沉淀产物WB二抗：抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，封闭缓冲液中需添加5%正常猪血清（S100-020）

凝胶推荐：3-8% Tris-乙酸酯凝胶

SEC16A分子量较大：预测分子量约250 kDa（实际因可变剪接可能为240–270 kDa）。使用低百分比Tris-乙酸酯凝胶可显著改善高分子量蛋白的分离效果。

样品制备建议：

使用人细胞裂解液（如HeLa、HEK293T、U2OS）作为阳性对照。SEC16A在多种细胞系中均有表达，但丰度较低，建议上样40–60 ?g总蛋白。

裂解液需包含蛋白酶抑制剂，因SEC16A可能被内源性蛋白酶降解。

上样前建议煮沸5分钟，但过度煮沸可能导致高分子量蛋白聚集，可尝试70°C加热10分钟作为替代。

4.2 免疫沉淀（IP）

推荐用量：6 ?g 抗体 / mg 蛋白裂解液

重要体积换算：本抗体浓度为200 ?g/ml，因此6 ?g对应 30 ?l 抗体体积（而非通常的6 ?l）。务必根据实际浓度计算。

操作流程如下：

1. 细胞裂解：推荐使用温和裂解缓冲液（如含0.5% NP-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4，添加蛋白酶抑制剂）。避免使用SDS，因其会破坏COPII复合物的相互作用。

2. 预清除：每个IP样本使用300–500 ?g总蛋白，与1 ?g同型兔IgG及20 ?l蛋白A/G琼脂糖珠孵育1小时。

3. 免疫沉淀：预清除上清中加入30 ?l A300-648A抗体（6 ?g），4°C旋转孵育过夜。

4. 捕获：加入30 ?l蛋白A/G珠，继续孵育2小时。

5. 洗涤：使用裂解缓冲液洗涤4次，每次5分钟；最后用高盐缓冲液（含300 mM NaCl）洗涤1次以降低非特异性背景。

6. 洗脱：加入30 ?l 2× SDS上样缓冲液（添加DTT），煮沸10分钟，离心后取上清进行WB检测。

IP产物WB检测注意事项：必须使用抗兔IgG轻链HRP抗体，并添加5%正常猪血清封闭，以避免重链（55 kDa）干扰SEC16A（250 kDa）的检测。由于目标条带远高于重链，实际上干扰风险较低，但轻链二抗仍是最佳实践。

4.3 关于WB稀释比的优化建议

由于SEC16A表达丰度相对较低且分子量大，建议从1:2,000开始试探，若背景过低可提高至1:5,000或1:10,000。若信号弱，可降低稀释比至1:1,000。初次实验时设置阳性对照（如HeLa裂解液）和阴性对照（如同型IgG IP）以确认抗体特异性。

五、储存与稳定性

未稀释抗体必须储存于2–8°C，严禁冷冻。冷冻会导致BSA和IgG的共聚集及活性丧失。在推荐条件下，自收货之日起可稳定保存1年。

缓冲液中含有0.09%叠氮化钠作为防腐剂，0.1% BSA作为稳定剂。BSA可减少抗体对管壁的非特异性吸附，尤其适合低浓度抗体（200 ?g/ml）的长期保存。若IP产物后续拟用于质谱分析，需通过脱盐柱去除叠氮化钠和BSA。分装建议：无需分装，使用原瓶并注意无菌操作即可。