兔抗Nanog抗体亲和纯化，避免干扰同源盒结构域DNA结合功能

一、产品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗Nanog多克隆抗体（货号：A300-397A），经抗原亲和纯化，特异性识别小鼠Nanog蛋白（同源盒转录因子）。抗体适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），反应种属为小鼠（Mouse）。抗体以未偶联（Unconjugated）的全IgG形式提供，浓度高达1000 ?g/ml，保存于2–8°C条件下，有效期自收货之日起为1年。产品原产于美国，适用于胚胎干细胞自我更新及分化研究中的Nanog蛋白检测与富集。

二、核心技术规格

参数项 | 具体规格

靶标 | Nanog

反应种属 | 小鼠

适用实验 | IP、WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗体形式 | 全IgG

免疫原 | 小鼠Nanog蛋白第1至50位氨基酸区域

同种型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属来源 | 小鼠

浓度 | 1000 ?g/ml

储存温度 | 2 – 8 °C

有效期 | 1年

缓冲液 | Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

表位信息：抗体识别的表位定位于小鼠Nanog同源盒蛋白的N端第1至50位氨基酸之间（参考TrEMBL条目Q80Z64，GeneID 71950）。该区域远离Nanog的同源盒结构域（DNA结合区），可避免干扰转录因子与DNA的相互作用，同时确保免疫沉淀后仍可检测到完整蛋白。

三、产品制备与质量控制

3.1 纯化工艺

抗体采用抗原亲和纯化：将对应小鼠Nanog蛋白N端1–50位氨基酸的合成多肽或重组蛋白片段共价固定于固相支持物上，使兔免疫血清过柱，特异性IgG被吸附；经充分洗涤去除未结合蛋白后，以低pH缓冲液洗脱目标抗体，随后中和、透析并置换至含防腐剂的缓冲液中。

3.2 浓度测定

免疫球蛋白浓度通过比尔-朗伯定律确定：1 mg/ml纯化IgG在280 nm波长处的吸光度（A280）为1.4。本产品批次实测A280值经换算确保浓度为1000 ?g/ml，批间一致性高。

3.3 纯度与特异性验证

抗原亲和纯化工艺可有效去除兔血清中的非特异性IgG及其他血清蛋白。经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估，抗体纯度典型值≥95%。功能性特异性通过以下方式验证：

在Nanog敲除小鼠胚胎干细胞（ESC）裂解物中WB检测无信号

过表达Nanog的细胞中信号显著增强

免疫沉淀后质谱鉴定确认仅富集Nanog及其已知相互作用伙伴

四、推荐应用与稀释方案

以下稀释及用量为推荐起始值。由于不同实验体系存在差异，用户需根据预实验结果进行优化。

4.1 免疫印迹（Western Blot，WB）

推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000

封闭与抗体稀释液：含5%脱脂奶粉的TBST（Tris缓冲盐+0.1% Tween-20）

一抗孵育条件：4°C 过夜（推荐）或室温2小时

推荐二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）抗体，货号A120-101P

特殊注意事项：当对免疫沉淀产物进行WB检测时，建议使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（轻链特异性），并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020），以避免重链交叉反应干扰目标蛋白信号（Nanog分子量约为42 kDa，与兔IgG重链55 kDa不重叠，但仍建议使用轻链二抗以获得更干净背景）。

阳性对照：小鼠胚胎干细胞（如E14、R1或CGR8细胞）全细胞裂解液。分化后的细胞（如经视黄酸处理）中Nanog表达显著下降，可用作阴性对照。

操作提示：Nanog为转录因子，主要定位于细胞核，提取裂解液时推荐使用含高盐（300–400 mM NaCl）的RIPA缓冲液以提高核蛋白提取效率。WB转膜后建议使用0.2 ?m PVDF膜以保留低分子量蛋白。

4.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

推荐用量：6 ?g 抗体 / mg 细胞裂解液总蛋白

裂解液选择：推荐使用温和非变性裂解液（如含150 mM NaCl、1% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、蛋白酶抑制剂混合物）。为保留Nanog与DNA或其他蛋白的相互作用，可使用低盐裂解液（100–150 mM NaCl）并添加核酸酶（Benzonase）裂解DNA，避免染色质共沉淀。

孵育条件：裂解液与抗体4°C旋转孵育2–4小时或过夜，随后加入Protein A琼脂糖珠（兔IgG优选Protein A）继续孵育1–2小时。

洗脱：可采用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5分钟洗脱，或使用低pH甘氨酸缓冲液进行非变性洗脱。

阴性对照：使用同种型兔IgG（非免疫IgG）进行平行沉淀，以评估非特异性背景。

注意：Nanog在ESC中的表达水平较高，建议每毫克裂解物使用6 ?g抗体以保证充分捕获。若用于低表达细胞系（如部分成体干细胞），可适当增加抗体用量至10–12 ?g/mg。

五、常见问题与解决方案

问题 | 可能原因 | 解决方案

WB信号弱或无信号 | 细胞分化或提取效率低 | 确认细胞未分化状态；改用核蛋白提取法；增加上样量至30–50 μg

IP后WB多条非特异带 | 重链干扰或非特异性结合 | 改用轻链特异性二抗；延长洗涤次数；降低抗体用量

背景过高 | 封闭不充分或抗体浓度过高 | 使用5%脱脂奶粉封闭至少1小时；稀释抗体至1:5,000–1:10,000

分子量偏移（>45 kDa） | 翻译后修饰或蛋白复合物未解离 | 增加SDS至2%并煮沸10分钟；添加蛋白酶抑制剂防止降解