兔抗E6AP抗体亲和纯化，助力Angleman综合征机制研究

E6AP 是一种 HECT 结构域泛素连接酶（E3），通过泛素?蛋白酶体途径介导底物蛋白降解。该基因母源突变导致 Angelman 综合征（AS），同时 E6AP 可与 HPV 16/18 型 E6 蛋白结合，促进 p53 降解，参与宫颈癌发生。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗E6AP抗体亲和纯化（货号：A300-352A） 经抗原亲和纯化，特异性识别 人 E6AP 蛋白第 400–450 位氨基酸 区域，适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），并交叉识别小鼠 E6AP。本文从产品规格、免疫原设计、实验操作方案、功能背景及故障排查等方面提供系统技术参考。

一、产品基本规格与储存信息

参数| 内容|

靶标| E6AP / UBE3A

反应性 | 小鼠、人类

应用| IP、WB

宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原 | 第400至450位氨基酸之间

亚型| IgG |

标记物 | 未标记

纯度| 抗原亲和纯

抗原种属 | 人类

浓度| 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

保存条件 | 2?–?8?°C

有效期 | 自收货之日起 1 年

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含 0.09% 叠氮化钠

储存与操作提示：  

抗体须始终保存于 2–8?°C，严禁冷冻，冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。  

叠氮化钠作为防腐剂，可能抑制 HRP 活性；若用于活细胞或体内实验，需通过脱盐柱去除。  

抗体浓度经比尔定律标定（A280?=?1.4 对应 1?mg/mL IgG），方便用户精确稀释。

二、推荐应用与实验条件

免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释范围：1:1,000 – 1:10,000（宽稀释窗口适应不同表达丰度样本）  

封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 过夜（推荐）  

二抗推荐：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

检测方式：增强型化学发光（ECL）

WB 优化流程

1. 样本制备：  

阳性对照：HeLa、HEK293 或 小鼠脑组织裂解液（小鼠 E6AP 在脑高表达）。  

裂解液：RIPA 缓冲液（含蛋白酶抑制剂），E6AP 分子量约 100?kDa。  

上样量：20–30?μg 总蛋白。

2. 电泳：使用 8% SDS?PAGE 或 4–12% 梯度胶。  

3. 转印：PVDF 膜，250?mA 恒流 90 分钟。  

4. 封闭：5% 脱脂牛奶 / TBST，室温 1 小时。  

5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:1,000 – 1:10,000 稀释（首次建议 1:2,000）。  

6. 洗涤：TBST 洗涤 3?×?10 分钟。  

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室温 1 小时。  

8. ECL 检测。

预期结果：应在约 100?kDa 处检测到单一条带。若出现多条带（常见约 75?kDa、50?kDa），可能为降解产物；建议提高一抗稀释度至 1:5,000 或 1:10,000，并确保样本新鲜。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗体 / mg 总蛋白裂解液  

裂解液要求：使用 非变性裂解缓冲液（如 50?mM Tris pH 7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 不含 SDS），添加蛋白酶抑制剂。

IP 详细步骤

1. 细胞裂解：收集 1–2 个 10?cm 皿细胞（约 5–10?×?10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分钟，离心取上清。  

2. 蛋白定量：BCA 法测定裂解液浓度。  

3. 预清除（可选）：加入 20?μL Protein?A/G 磁珠，4?°C 旋转 1 小时。  

4. 抗体结合：取 1?mg 总蛋白，加入 6?μg A300-352A 抗体，4?°C 旋转孵育过夜。  

5. 捕获复合物：加入 30?μL Protein?A 磁珠，继续孵育 2 小时。  

6. 洗涤：用 IP 裂解液洗涤磁珠 4–5 次。  

7. 洗脱：加入 30?μL 2× SDS 上样缓冲液（含 DTT），95?°C 加热 10 分钟。  

8. WB 检测：取上清进行 SDS?PAGE。

IP?WB 的特殊注意事项

E6AP 分子量约 100?kDa，远高于抗体重链（≈55?kDa），理论上常规抗兔 H+L 二抗不会干扰。但为确保最洁净背景（尤其检测低丰度互作蛋白时），仍推荐使用 抗兔 IgG 轻链特异性 HRP 二抗，并在封闭液中添加 5% 正常猪血清（货号 S100?020），以彻底消除重链信号。

IP 阳性对照：可使用已知与 E6AP 相互作用的蛋白（如 HPV E6、p53）进行共沉淀验证。

三、该抗体的核心优势

人/小鼠交叉反应性：无需分别采购不同种属抗体，尤其适合转基因小鼠模型及 AS 研究。  

亲和纯化低背景：WB 可实现 1:10,000 稀释，IP 背景干净。  

配方化 IP 用量：6?μg/mg 裂解物，避免抗体过量浪费。  

宽 WB 稀释窗口（1:1,000–1:10,000）：适应高表达（肿瘤细胞）和低表达（部分原代细胞）样本。  

液态稳定保存：2–8?°C 一年，无需分装冻融。  

表位位于 HECT 上游：不影响识别天然构象，可用于 IP 检测蛋白复合物。

四、汇总信息表（快速参考）

应用稀释速查：  

WB：1:1,000 – 1:10,000（5% 牛奶/TBST，4?°C 过夜）  

IP：6?μg/mg 裂解物  

二抗推荐：  

WB 常规：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

IP?WB：anti?Rabbit IgG Light Chain HRP + 5% 正常猪血清（S100?020）  

阳性对照：HeLa 细胞（人）、小鼠全脑裂解液（鼠）  

储存：2–8?°C，严禁冷冻；有效期 1 年