兔抗GAPDH抗体亲和纯化，高特异性内参，适合珍贵样本

GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）是糖酵解途径中的关键代谢酶，催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化为1,3-二磷酸甘油酸。除了经典的代谢功能外，GAPDH 还参与囊泡运输、DNA 修复、DNA 复制、细胞骨架调控及 tRNA 核输出等非代谢过程，常作为 Western Blot 和免疫组织化学中的内参蛋白使用。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗GAPDH抗体亲和纯化抗体（货号：A300-639A ） 经抗原亲和纯化，特异性识别 人 GAPDH 蛋白第 150–200 位氨基酸 区域，适用于免疫组织化学（IHC）和免疫印迹（WB），并交叉识别人和小鼠 GAPDH。本文基于详细产品规格，从基本特性、免疫原设计、实验优化流程、功能背景及常见问题排查等方面提供系统性技术参考。

一、产品基本规格与储存信息

参数| 内容

靶标| GAPDH（G3PD）

反应性| 小鼠、人类

应用| IHC、WB

宿主/克隆性  | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 第175至225位氨基酸之间（具体表位位于第150–200位）

亚型| IgG

标记物| 未标记

纯度| 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人类

浓度| 200 ?g/ml

保存条件 | 2?–?8?°C

有效期| 自收货之日起 1 年

缓冲液| Tris-缓冲盐水，含 0.1% BSA 及 0.09% 叠氮化钠

储存与操作提示：  

抗体须始终保存于 2–8?°C，严禁冷冻，冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。  

缓冲液中含有 0.1% BSA 作为稳定蛋白，有助于提高稀释后的抗体稳定性；叠氮化钠为防腐剂，可能抑制 HRP 活性，若用于活细胞实验需去除。  

抗体浓度为 200??g/ml，较常见内参抗体略低，使用时注意稀释倍数计算。  

浓度采用比尔定律标定（A280?=?1.4 对应 1?mg/mL IgG）。

二、推荐应用与实验条件

免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000  

封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 过夜（或室温 2 小时）  

二抗推荐：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

检测方式：增强型化学发光（ECL），也可使用显色法（如 DAB）

WB 优化流程（作为内参或检测目标蛋白）

1. 样本制备：  

阳性对照：HeLa、HEK293、NIH/3T3、小鼠肝脏或脑组织裂解液。  

裂解液：RIPA 或 SDS 上样缓冲液均可（GAPDH 高度稳定）。  

上样量：5–10?μg 总蛋白 即可获得强信号（内参常用量）。

2. 电泳：使用 10–12% SDS?PAGE（GAPDH 分子量约 36?kDa）。  

3. 转印：PVDF 或硝酸纤维素膜，250?mA 恒流 60 分钟。  

4. 封闭：5% 脱脂牛奶 / TBST，室温 30–60 分钟。  

5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:2,000 – 1:10,000 稀释（首次建议 1:5,000）。  

6. 洗涤：TBST 洗涤 3?×?10 分钟。  

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室温 45 分钟。  

8. 洗涤后 ECL 检测。

预期结果：应在约 36?kDa 处检测到一条清晰、均一的条带。GAPDH 表达丰度极高，过度曝光或上样量过大可能导致条带过饱和或拖尾，建议使用较短的曝光时间（如 1–30 秒）。

作为内参的注意事项

GAPDH 表达在不同组织、细胞类型及处理条件下可能存在差异（如缺氧、高糖、某些药物处理），实验设计中应设置合适的对照。  

对于代谢相关研究，建议同时使用另一种内参（如 β?actin 或 Tubulin）进行验证。  

该抗体在 WB 中特异性高，背景干净，适合用于定量分析。

免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）

推荐稀释范围：1:500 – 1:2,000  

抗原修复：柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），微波或高压热修复 10–15 分钟。  

样本类型：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的人或小鼠组织切片。  

封闭：5% 正常血清 / PBS 或 3% BSA / PBS，室温 30 分钟。  

检测：HRP/DAB 显色或荧光二抗。

IHC 实验流程要点

1. 脱蜡与水化：常规二甲苯、梯度乙醇处理。  

2. 抗原修复：推荐使用柠檬酸缓冲液 pH?6.0，高压锅修复 2–3 分钟或微波煮沸 15 分钟。冷却至室温。  

3. 通透（可选）：0.2% Triton X?100 / PBS，10 分钟（若检测膜/核抗原）。  

4. 封闭：5% 正常山羊血清 / PBS，室温 30 分钟。  

5. 一抗孵育：用封闭液稀释抗体至 1:500–1:2,000（首次推荐 1:1000），4?°C 过夜。  

6. 洗涤：PBS 洗涤 3?×?5 分钟。  

7. 二抗孵育：HRP 或荧光标记抗兔二抗，室温 1 小时。  

8. 显色：DAB（棕色）/ AEC（红色）或荧光封片。

预期染色模式：GAPDH 在细胞质中广泛表达（部分细胞核也有表达），IHC 染色应为胞质均一阳性。建议使用肾、肝或肿瘤组织作为阳性对照，胞质无染色作为阴性对照（如仅用二抗）。