兔抗MAD2抗体亲和纯化，助力基因组稳定性与癌症机制解析

产品概述

MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）是纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint, SAC）的核心组分，确保在所有染色体正确排列到赤道板之前不启动后期，从而维持基因组稳定性。本文介绍的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗MAD2抗体亲和纯化（货号：A300-300A）是一款兔源多克隆抗体，特异性识别MAD2蛋白，适用于免疫组织化学（IHC）和免疫沉淀（IP）应用，反应种属为人。

基本规格

抗体类型：兔多克隆IgG，完整IgG形式，未偶联。

免疫原：对应人MAD2蛋白第100至150位氨基酸残基区间，参考SwissProt条目Q13257（GeneID 4085）。

纯化方式：抗原亲和纯化——将特异性表位固定于固相载体，富集高特异性抗体。

浓度：1000 ?g/ml（测定方法：比尔定律，1 mg/mL IgG在A280nm处吸光度为1.4）。

缓冲体系：Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。

储存与稳定性：2-8°C保存，自收货之日起稳定期1年。

反应种属与特异性

已验证反应种属：人（Human）。抗体识别表位位于MAD2蛋白第100-150区域。建议用户根据实验需求验证其他种属（如小鼠、大鼠等）的交叉反应性。MAD2在哺乳动物中高度保守，但在使用前仍需通过阳性对照确认。

推荐应用与实验条件

1. 免疫沉淀（IP）

用量：每毫克细胞裂解液蛋白使用6 ?g抗体

适用样本：人源细胞裂解液（如HeLa、HEK293、U2OS等）

实验要点：

裂解液建议使用非变性裂解缓冲液（如含1% NP-40或Triton X-100的TBS或PBS），以维持MAD2与MCC复合物（BubR1、Bub3、Cdc20）的相互作用。

建议设置兔IgG同型对照，以评估非特异性沉淀背景。

洗脱可采用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸变性，或使用低pH甘氨酸缓冲液进行温和洗脱。

2. 免疫组织化学（IHC）

推荐稀释比：1:1,000 至 1:5,000

抗原修复：对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，推荐使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行热诱导抗原修复。

适用样本：人源组织切片（如肿瘤组织、正常增殖组织）

注意事项：MAD2在增殖活跃的细胞中高表达，在静止期细胞中表达较低。建议使用已知高表达的组织（如扁桃体、睾丸或肿瘤组织）作为阳性对照。

MAD2（MAD2L1）的生物学功能

MAD2（Gene Symbol: MAD2L1，Gene ID: 4085，UniProt ID: Q13257）也称为有丝分裂纺锤体组装检查点蛋白MAD2A，是有丝分裂检查点的关键调节因子。

主要功能：

纺锤体组装检查点（SAC）：MAD2定位于未附着的动粒上，感知微管附着状态和张力。当存在未正确附着的染色体时，MAD2激活并阻止细胞进入后期。

MCC复合物：MAD2与BubR1、Bub3、Cdc20共同组成有丝分裂检查点复合物（MCC）。该复合物直接结合并抑制后期促进复合物/细胞周期体（APC/C），从而阻止姐妹染色单体分离和细胞周期进展。

调控机制：MAD2的活性和定位受MAD1调控。MAD1将MAD2招募至动粒，并促进MAD2从封闭构象向开放构象的转换，这是激活检查点信号所必需的。

与癌症的关系：MAD2表达异常（过表达或下调）与染色体不稳定性、非整倍体以及多种人类癌症（如乳腺癌、结直肠癌、肝癌等）的发生发展密切相关。

其他别名：HSMAD2、MAD2、MAD2-like protein 1、MAD2L1、mitotic arrest deficient 2-like protein 1。

技术建议与注意事项

稀释优化

IHC推荐的1:1,000-1:5,000为起始范围。由于MAD2在细胞周期中表达水平波动（在G2/M期达到高峰），建议使用同步化细胞（如诺考达唑处理）制备的细胞沉淀石蜡切片或细胞涂片进行预实验，以确定最佳稀释比。

IHC抗原修复条件

柠檬酸缓冲液（pH 6.0）是本抗体的推荐修复条件。操作步骤：

修复液：10 mM柠檬酸三钠，0.05% Tween 20，用HCl调至pH 6.0

修复方式：使用微波炉高火煮沸后转低火维持15-20分钟，或使用高压锅修复2-3分钟

自然冷却至室温（约20-30分钟），避免骤冷导致组织脱片

冷却后用PBS洗涤3次，每次5分钟

注意：不推荐使用Tris-EDTA（pH 9.0）等高pH修复液，可能导致信号减弱或背景增高。

免疫沉淀策略

研究MAD2在有丝分裂检查点中的功能时，可采用以下IP策略：

检测MCC复合物组装：使用MAD2抗体进行IP，然后WB检测BubR1、Bub3、Cdc20。建议设置以下对照：

未处理细胞（间期对照）vs 诺考达唑或紫杉醇处理细胞（有丝分裂阻滞对照）

IgG同型对照

检测MAD2-MAD1相互作用：IP MAD2后WB检测MAD1，反之亦然。该相互作用在未附着动粒上增强。

样本同步化：为了捕获动态相互作用，建议使用双胸苷阻断或诺考达唑释放进行细胞周期同步化。

叠氮化钠的影响

缓冲液中含0.09%叠氮化钠。虽然在IP和IHC中影响较小，但需注意：

HRP检测系统：若IHC使用HRP标记的二抗，叠氮化物会抑制HRP活性。在二抗孵育前通过充分洗涤（3次×5分钟）去除叠氮化物即可。

长期储存：叠氮化物作为防腐剂，允许2-8°C长期保存。但如需对抗体进行标记（如生物素化或荧光标记），应通过脱盐或透析去除叠氮化物。

IHC常见问题排查

问题1：无信号或信号弱

可能原因：抗原修复不充分、抗体稀释度过高、组织固定过度

解决方案：延长修复时间（微波修复20-25分钟）；使用更低稀释比（如1:500）；改用冻存切片；尝试不同的修复液（如Tris-EDTA pH 9.0，但本抗体未经验证，需自行测试）

问题2：高背景或弥散染色

可能原因：抗体浓度过高、封闭不充分、内源性过氧化物酶未阻断（如使用HRP系统）

解决方案：提高稀释比（1:5000或更高）；延长封闭时间（室温1小时或4°C过夜）；使用含5%正常山羊血清的封闭液；用3% H?O?处理10分钟以淬灭内源性过氧化物酶

问题3：核外染色

说明：MAD2在细胞周期中主要定位于细胞核（特别是动粒），但在未附着动粒处呈点状分布。若出现弥漫性胞质染色，可能是抗体浓度过高或特异性问题。建议降低稀释比并参考已发表的组织染色图像。

IP实验优化提示

裂解液选择：

标准裂解液：50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂

维持复合物：避免使用SDS；可添加0.1% Triton X-100替代NP-40

交联：若研究弱相互作用，可考虑使用可逆交联剂（如DSP）处理细胞，然后在IP后洗脱前解交联

抗体固定：为减少重链污染，可将抗体共价交联至Protein A/G磁珠后再进行IP

洗涤严格性：使用含500 mM NaCl的高盐洗涤缓冲液可减少非特异性结合