兔抗RPA32抗体亲和纯化，同时适用于WB/IP/IHC等多种应用，节约样本与成本

一、产品概述

本产品为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗RPA32（人复制蛋白A 32 kDa亚基）多克隆抗体（货号：A300-244A），经抗原亲和纯化，以全IgG形式提供，未偶联标记。该抗体特异性识别RPA复合物中的32 kDa亚基（RPA2），反应性涵盖小鼠和人源样本，适用于流式细胞术（Flow Cyt）、免疫组织化学（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印迹（WB）等多种应用。产品浓度为1000 ?g/ml，储存于2-8°C，有效期为收货后一年。

二、产品规格参数

参数 规格

靶点 RPA32（RPA2）

反应性 小鼠、人

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全IgG

免疫原 人RPA2蛋白第225位至C末端（第270位）区域

同型 IgG

偶联物 未偶联

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 ?g/ml

缓冲液 Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮化钠

储存温度 2-8°C

有效期 收货后1年

三、生产工艺与质量控制

3.1 免疫原设计

本抗体识别的表位位于人RPA2蛋白第225位残基至C末端（第270位）区域（参考序列NP_002937.1，GeneID 6118）。该区域包含RPA32的C端结构域，与亚基间相互作用及磷酸化调控密切相关。

3.2 纯化流程

采用固相载体固定的RPA32表位特异性抗原进行亲和纯化，获得高纯度、低背景的抗体。抗体浓度通过比尔定律测定：1 mg/ml IgG在280 nm波长的吸光度为1.4。

3.3 质量控制

纯度：抗原亲和纯化，不含非特异性兔IgG

效价：WB推荐稀释度可达1:10,000，IHC可达1:10,000

特异性：经人及小鼠样本验证

四、推荐应用与实验方法

4.1 免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释度：1:2,000 - 1:10,000

4.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

推荐用量：6 ?g/mg裂解物

4.3 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）

推荐稀释度：1:2,000 - 1:10,000

FFPE组织切片流程：

1. 脱蜡与水化：常规二甲苯和梯度乙醇处理

2. 抗原修复：推荐使用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0），高压热修复或微波修复2-3分钟

3. 内源性过氧化物酶封闭：3% H?O?处理10-15分钟（如使用HRP检测系统）

4. 封闭：5%正常山羊血清或BSA室温封闭30分钟

5. 一抗孵育：按推荐稀释度稀释抗体，4°C过夜

6. 二抗及检测：使用HRP标记的抗兔二抗，DAB显色，苏木精复染

阳性对照：增殖活跃的组织（如扁桃体、小肠隐窝上皮、肿瘤组织）的细胞核应呈阳性染色。

4.4 流式细胞术（Flow Cytometry）

推荐用量：1 ?l / 1 × 106 细胞

五、储存与稳定性

储存温度：2-8°C，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性、聚集和效价下降。

缓冲体系：Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 7-8），含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。

有效期：收货后1年内稳定。建议分装成单次使用量，储存于2-8°C，避免污染。

运输条件：冰袋运输。收到后请立即检查是否浑浊或沉淀。

六、使用注意事项

1. 叠氮化钠影响：缓冲液含0.09%叠氮化钠，对细胞有毒，且抑制HRP活性。若计划进行细胞培养添加实验或HRP标记，需通过透析或脱盐柱去除叠氮化钠。

2. 多克隆抗体批次差异：不同批次间可能存在效价差异，建议对大批量实验预留批次间验证环节。

3. 交叉反应性：已验证对小鼠和人RPA32有反应性。其他种属（如大鼠、猴）需自行验证。

4. 磷酸化状态的影响：本抗体识别区域为第225-270位（C端），不依赖于磷酸化状态，可检测总RPA32蛋白。如需特异性检测磷酸化RPA32（如Ser4/Ser8），建议使用磷酸化特异性抗体。

5. 稀释度优化：推荐稀释度为一般参考范围，实际最佳稀释度需根据样本类型、实验体系和检测灵敏度进行梯度预实验确定。

七、典型实验流程示例（WB快速方案）

准备工作：

制备RPA32表达阳性的细胞裂解液（如HeLa、293T细胞）

进行BCA法蛋白定量

步骤：

1. 取20-50 ?g蛋白/孔，进行SDS-PAGE（12%分离胶）

2. 转膜至PVDF膜（0.45 ?m孔径），恒流300 mA，90分钟

3. 5% Milk-TBST室温封闭1小时

4. 一抗：1:5,000稀释于5% Milk-TBST，4°C摇床孵育过夜

5. TBST洗涤3次，每次10分钟

6. 二抗：山羊抗兔HRP二抗（1:5,000 - 1:10,000），室温孵育1小时

7. TBST洗涤3次

8. ECL化学发光显影，曝光观察32 kDa条带

预期结果：在增殖细胞中可见清晰的32 kDa条带；DNA损伤处理（如紫外线、依托泊苷）后，可能观察到条带迁移率改变（磷酸化导致的电泳迁移滞后）。

八、相关产品推荐

产品类型 货号/名称 用途

山羊抗兔IgG（H+L） A120-101P WB二抗

抗兔IgG轻链HRP偶联物 - IP-WB检测，避免重链干扰

正常猪血清 S100-020 IP-WB封闭添加物

RPA32阳性对照裂解液 自制或市售 WB/IHC阳性对照

Tris-EDTA修复液（pH 9.0） - IHC抗原修复