兔抗ATR抗体亲和纯化，低背景IP-WB联用优化方案

产品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的ATR抗体（货号A300-138A）是一种兔源多克隆抗体，特异性靶向人源ATR（Ataxia Telangiectasia and Rad3-related）蛋白，即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR。该抗体以全IgG形式提供，浓度为1000 ?g/ml，经抗原亲和纯化，未偶联标记物，适用于免疫沉淀（IP）和Western Blot（WB）检测。

免疫原与特异性

本抗体的免疫原对应人源ATR蛋白第1675至1725位氨基酸残基之间的区域，参考序列号为NP_001175.1（GeneID 545）。通过表位特异性亲和纯化工艺，将针对ATR固定化表位的抗体从抗血清中分离纯化，确保高特异性识别目标抗原。

ATR属于磷脂酰肌醇3激酶相关激酶（PIKK）家族，分子量约为300 kDa，本抗体识别的表位位于蛋白中段靠近C端的区域，能够有效检测全长ATR蛋白。

技术参数

参数 | 详细信息

靶标 | ATR (ATR serine/threonine kinase)

反应性 | 人

应用 | 免疫沉淀（IP）、Western Blot（WB）

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全IgG

免疫原 | 第1675–1725位氨基酸区间

同型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人

浓度 | 1000 ?g/ml

储存条件 | 2–8 °C

保质期 | 收货后1年

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

浓度测定方法

免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定，其中1 mg/ml IgG在280 nm波长下的吸光度（A280）为1.4。

Western Blot实验方案

推荐稀释度

1:2,000 – 1:10,000

凝胶选择

推荐使用3-8% Tris-醋酸凝胶。ATR蛋白分子量约300 kDa，在传统Tris-甘氨酸凝胶中分离效果不佳。Tris-醋酸缓冲系统对高分子量蛋白的分离分辨率显著提高，建议优先采用。

实验条件

封闭及稀释液：5%脱脂牛奶-TBST

一抗孵育：过夜孵育（4°C）

二抗（细胞裂解液WB）：山羊抗兔IgG重链和轻链抗体（货号A120-101P）

二抗（免疫沉淀物WB）：使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020），以避免免疫沉淀洗脱物中IgG重链（约55 kDa）对目标信号产生干扰。

免疫沉淀实验方案

推荐用量：6 ?g抗体/mg细胞裂解物

裂解液建议：推荐使用RIPA缓冲液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂）裂解细胞，以充分释放ATR并保留其磷酸化状态。

捕获基质：使用Protein A琼脂糖或磁珠（兔源抗体适用）。

孵育时间：抗体与裂解液4°C孵育2小时至过夜，后加入Protein A介质继续孵育1-2小时。

靶点背景信息

蛋白功能

ATR（ATM与Rad3相关蛋白）是PIKK家族的成员，与ATM紧密相关，作为DNA损伤的早期感受器发挥核心作用。ATR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，主要响应紫外线（UV）损伤和DNA复制叉停滞信号。

ATR通过以下机制参与DNA损伤应答：

损伤感知：ATR与其结合伙伴ATRIP（ATR interacting protein）形成复合物，识别被复制蛋白A（RPA）包被的单链DNA区域。单链DNA是DNA复制胁迫和多种损伤的共同中间体。

底物磷酸化：在DNA损伤或复制压力下，ATR磷酸化大量下游底物，包括：

BRCA1：参与同源重组修复和细胞周期检查点调控。

p53：激活转录依赖性细胞周期阻滞和凋亡。

Chk1（文献中Chk2也提及，但主要底物为Chk1）：介导细胞周期检查点，抑制CDK活性。

Rad17：装载PCNA-like检查点复合物到损伤位点。

E2F转录因子1：调控细胞周期进程。

与染色质重塑复合物的交互：ATR可能通过与Rad17及核小体重塑复合物的组分相互作用来感知DNA损伤。

别称

ataxia telangiectasia and Rad3-related protein、FCTCS、FRAP-related protein 1 (FRP1)、MEC1、SCKL、SCKL1