兔抗SMC2抗体亲和纯化，WB单条带识别135-140kDa，避免与SMC1/SMC3交叉

SMC2 是 condensin 复合物的核心组分，与 SMC4 形成异源二聚体，在染色质凝集、有丝分裂染色体塑造及 DNA 损伤应答中发挥关键作用。该抗体 A300-058A 经过抗原亲和纯化，特异性识别人 SMC2 蛋白的 C 端区域（第 1150–1197 位氨基酸），适用于免疫细胞化学（ICC）、免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB）。本文基于由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗SMC2抗体亲和纯化抗体（货号：A300-058A）详细的规格，从基本特性、免疫原设计、各应用优化流程、功能背景及常见问题排查等方面提供系统性技术参考。

一、产品基本规格与储存信息

参数| 内容

靶标| SMC2（CAP-E）

反应性| 人类

应用| ICC、IP、WB

宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 位于第 1147 位残基至 C 末端之间（具体 1150?1197）

亚型| IgG

标记物| 未标记

纯度| 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人类

浓度| 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

保存条件 | 2?–?8?°C

有效期 | 自收货之日起 1 年

缓冲液| Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含 0.09% 叠氮化钠

> 储存与操作提示：  

> - 抗体应始终保存于 2–8?°C，切勿冷冻，冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。  

> - 叠氮化钠作为防腐剂，可能抑制 HRP 活性；若需用于活细胞成像（如 ICC 前的活细胞标记），建议通过脱盐柱去除。  

> - 抗体浓度通过比尔定律标定（A280?=?1.4 对应 1?mg/mL IgG），用户可根据此值进行精确稀释。

二、推荐应用与实验条件

免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000  

封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 过夜（推荐）或室温 2?3 小时  

二抗推荐：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

检测方式：增强型化学发光（ECL）

WB 实验流程优化

1. 样本制备：  

推荐阳性对照：HeLa、HEK293、K562 等人类细胞系全裂解液。  

使用 RIPA 裂解液（50?mM Tris?HCl pH 7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS），添加蛋白酶抑制剂。  

上样量：20–40?μg 总蛋白（SMC2 表达丰度中等）。

2. 电泳：  

建议使用 3–8% Tris?乙酸酯凝胶 或 6–8% SDS?PAGE（SMC2 分子量约 135–140?kDa）。  

电泳缓冲液：Tris?甘氨酸 SDS 或 Tris?乙酸酯 SDS。

3. 转印：  

使用 PVDF 膜（0.45?μm），甲醇活化。  

转印条件：250?mA 恒流，120 分钟；或 30?V 恒压，4?°C 过夜。

4. 封闭：5% 脱脂牛奶 / TBST，室温 1 小时。

5. 一抗孵育：  

用 5% 牛奶 / TBST 稀释抗体至 1:2,000 – 1:10,000（首次建议 1:2,000）。  

- 4?°C 轻摇过夜。

6. 洗涤：TBST 洗涤 3–4 次，每次 8–10 分钟。

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔二抗（1:10,000–1:20,000），室温 1 小时。

8. 再次洗涤后 ECL 检测。

> 预期结果：应在约 135–140?kDa 处检测到单一条带。若出现多条低分子量条带，提示蛋白降解或非特异性结合；可提高稀释度至 1:10,000 并确保样本新鲜。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗体 / mg 总蛋白裂解液  

裂解液要求：使用非变性裂解缓冲液（不含 SDS，如 50?mM Tris pH 7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 0.5% 脱氧胆酸钠），添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

IP 详细步骤

1. 细胞裂解：培养 1–2 个 10?cm 皿细胞（约 5–10?×?10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分钟，离心取上清。  

2. 预清除（可选）：加入 20?μL Protein?A 磁珠，4?°C 旋转 1 小时。  

3. 抗体结合：取 1?mg 总蛋白，加入 6?μg A300-058A 抗体，4?°C 旋转孵育过夜。  

4. 捕获复合物：加入 30?μL Protein?A 磁珠，继续孵育 2 小时。  

5. 洗涤：用 IP 裂解液洗涤磁珠 4–5 次。  

6. 洗脱：加入 30?μL 2× SDS 上样缓冲液（含 DTT），95?°C 加热 10 分钟。  

7. WB 检测：取上清进行 SDS?PAGE。

IP?WB 的特殊注意事项

由于 IP 洗脱液中含有抗体轻链（≈25?kDa）和重链（≈55?kDa），而 SMC2 分子量约 135–140?kDa（远高于重链），理论上常规抗兔 H+L 二抗不会产生重叠干扰。但为获得最干净的印迹，仍推荐使用 抗兔 IgG 轻链特异性 HRP 二抗，并在封闭液中添加 5% 正常猪血清（货号 S100?020），以彻底消除重链信号的潜在干扰。

免疫细胞化学（Immunocytochemistry, ICC）

推荐稀释范围：1:200 – 1:400  

固定与通透：推荐 4% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟，随后用 0.2% Triton?X?100 / PBS 通透 10 分钟。  

封闭：5% 正常山羊血清 / PBS（或 3% BSA / PBS），室温 30 分钟。  

一抗孵育：用封闭液稀释抗体至 1:200–1:400，4?°C 过夜。  

二抗：使用荧光标记的抗兔二抗（如 Alexa Fluor 488 或 568），稀释比参照产品说明，室温孵育 1 小时。  

核染色：DAPI（1?μg/mL）或 Hoechst 33342，室温 5 分钟。  

封片与观察：使用抗荧光淬灭封片剂，共聚焦或荧光显微镜成像。

> 细胞周期依赖性信号：SMC2 作为 condensin 亚基，在有丝分裂期高度富集于染色体上。在间期细胞中，染色通常呈弥散核质分布，部分聚集于染色质区域。建议使用同步化细胞（如用诺考达唑处理获得有丝分裂细胞）作为阳性对照，以验证抗体在 ICC 中的性能。

三、该抗体的核心优势

三重应用验证：ICC、IP、WB 全覆盖，一套抗体满足不同实验需求。  

C 末端特异性表位：避免与其他 SMC 家族蛋白交叉反应，WB 条带单一。  

高稀释度 WB：1:10,000 仍可获得强信号，经济性突出。  

IP 用量配方化：6?μg/mg 裂解物，无需梯度摸索。  

液态稳定保存：2–8?°C 一年有效，避免分装冻融损失。