兔抗MDC1抗体亲和纯化，极高灵敏度覆盖低丰度样本

MDC1（Mediator of DNA Damage Checkpoint 1）是DNA损伤应答（DDR）通路中的关键支架蛋白，在组蛋白H2AX Ser?139磷酸化（γH2AX）信号放大及下游检查点激活过程中发挥核心作用。该抗体A300-051A经抗原亲和纯化，专一识别人类MDC1蛋白第475–525位氨基酸区域，适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB）。特别是其WB稀释范围高达1:10,000–1:25,000，展示了极高的灵敏度和特异性。本文将从由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗MDC1抗体亲和纯化抗体（货号：A300-051A）规格、免疫原设计、优化实验方案、分子功能及疑难排除等方面提供完整的技术参考。

一、产品基本规格与储存信息

参数| 内容

靶标| MDC1（NFBD1）

反应性| 人类

应用| IP、WB

宿主/克隆| 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 位于第475至525位氨基酸之间

亚型| IgG

标记物| 未标记

纯度| 抗原亲和纯化

抗原种属| 人类

浓度| 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

保存条件| 2?–?8?°C

有效期| 自收货之日起 1 年

缓冲液| Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含 0.09% 叠氮化钠

> 关键储存提示：  

> - 始终保存于 2–8?°C，切勿冷冻；冷冻会导致抗体聚集和效价衰减。  

> - 叠氮化钠为防腐剂，可能会抑制辣根过氧化物酶（HRP）活性。若计划将抗体用于活细胞成像或体内实验，需通过脱盐柱或透析去除。  

> - 浓度采用比尔定律标定（A280?=?1.4 对应 1?mg/mL IgG），用户可根据此值进行精确稀释。

二、推荐应用与实验条件

免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释范围：1:10,000 – 1:25,000（极高稀释度，充分体现抗体高亲和力与低背景）  

凝胶建议：3?8% Tris?乙酸酯凝胶（Tris?acetate gel），更适合检测 MDC1 约 220–250?kDa 的大分子量。  

封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 过夜（或室温 2?3 小时，但过夜信号更强）  

二抗推荐：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120?101P）  

检测方式：增强型化学发光（ECL），建议使用高灵敏度底物（如 SuperSignal West Dura）。

WB 优化实验流程

1. 样本制备：  

推荐阳性对照：HeLa、HEK293、U2OS 或其它人类细胞系全裂解液。  

裂解缓冲液：RIPA（50?mM Tris?HCl pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS）添加蛋白酶抑制剂（PMSF +  cocktail）。  

上样量：20–40?μg 总蛋白（MDC1 为中等丰度蛋白，过量上样可能造成拖尾）。

2. 电泳：  

使用 3?8% Tris?乙酸酯预制胶或自配胶。  

电泳缓冲液：Tris?乙酸酯 SDS 运行缓冲液。  

电压：150?V 恒压，约 60?80 分钟。

3. 转印：  

推荐 PVDF 膜（0.45?μm），甲醇活化后转印。  

转印条件：30?V 恒压，4?°C 过夜（或 250?mA 恒流，120 分钟）。  

可使用丽春红染色确认转印效率及分子量位置。

4. 封闭：  

5% 脱脂牛奶 / TBST，室温摇动 1 小时。

5. 一抗孵育：  

用 5% 牛奶 / TBST 将抗体稀释至 1:10,000 – 1:25,000（首次实验建议从 1:10,000 开始）。  4?°C 轻摇过夜（16?18 小时）。

6. 洗涤：  

TBST 洗涤 4 次，每次 8 分钟。

7. 二抗孵育：  

用 5% 牛奶 / TBST 稀释 HRP?山羊抗兔二抗（如 1:10,000）。  

室温孵育 1 小时。

8. 再次洗涤（同步骤 6），ECL 检测。

> 性能预期：在合适条件下，应在约 220–250?kDa 处检测到单一条带。若在 200?kDa 以下出现多条带，可能是蛋白降解或非特异性结合；建议增加蛋白酶抑制剂并适当提高一抗稀释度。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗体 / mg 总蛋白裂解液  

样本要求：使用非变性裂解缓冲液（如 50?mM Tris pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 不含 SDS，添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。  

推荐对照：使用同型兔 IgG 作为阴性对照（针对非特异性结合）。

IP 详细步骤

1. 裂解：  

收集细胞（约 5–10 × 10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分钟。  

4?°C，12,000?×g 离心 15 分钟，取上清。

2. 预清除（可选）：  

加入 20?μL Protein?A/G 磁珠（或琼脂糖珠），4?°C 旋转 1 小时，取上清。

3. 抗体结合：  

测定裂解液蛋白浓度（BCA 法）。  

取 1?mg 总蛋白，加入 6?μg A300-051A 抗体。  

4?°C 旋转孵育 2 小时或过夜。

4. 捕获免疫复合物：  

加入 30?μL Protein?A 磁珠，4?°C 继续旋转 1?–?2 小时。

5. 洗涤：  

用 IP 裂解液洗涤磁珠 4 次（每次 500?μL，4?°C，磁力架分离）。

6. 洗脱：  

加入 30?μL 2× SDS 上样缓冲液（含 DTT），95?°C 加热 10 分钟。  

取上清进行 SDS?PAGE 及 WB 检测。

IP 后 WB 的特殊注意事项

由于免疫沉淀洗脱液中存在抗体轻链（≈25?kDa）和重链（≈55?kDa），而 MDC1 分子量为 220?kDa（远高于重链），理论上常规二抗（抗兔 IgG H+L）不会产生干扰。但仍建议使用 抗兔 IgG 轻链特异性 HRP 二抗，并在封闭液中添加 5% 正常猪血清（货号 S100?020），以彻底消除残余重链信号的可能性。