兔抗6-His标签抗体亲和纯化，识别C端及内部his标签，检测更可靠

产品概述

本品为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗6-His标签多克隆抗体（货号：A190-114A），经抗原亲和纯化，以未标记形式提供。6-His标签（HHHHHH）是重组蛋白表达中最常用的表位标签之一，广泛应用于蛋白纯化与检测。本抗体可特异性识别C端或内部插入的六个连续组氨酸残基，适用于酶联免疫吸附测定、免疫细胞化学、免疫沉淀及免疫印迹等多种实验场景，是重组蛋白表达鉴定和纯化监测的实用工具。

基本规格参数

参数 具体信息

靶标 6-His标签（HHHHHH）

应用 ELISA, ICC, IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全IgG

自身抗体亚型 IgG

标记物 未标记

纯度 抗原亲和纯化

浓度 1 mg/ml

保存温度 2 - 8 °C

有效期 自收货之日起1年

缓冲液 含0.09%叠氮钠的磷酸盐缓冲盐水

生产与纯化工艺

本抗体的生产采用KLH偶联6-His多肽作为免疫原。具体流程如下：

1.免疫原制备：将六个组氨酸组成的合成多肽（HHHHHH）与血蓝蛋白（KLH）偶联，增强免疫原性。

2.免疫程序：使用上述偶联物对兔进行多次免疫，诱导产生抗6-His标签的抗血清。

3.亲和纯化：将6-His多肽固定于固相支持介质上，通过亲和层析从抗血清中特异性分离目标抗体。

4.浓度测定：依据比尔定律，1 mg/ml IgG在280 nm波长下的吸光度（A280）为1.4。本品最终浓度为1 mg/ml。

重要限制说明：经验证，本抗体不能检测所有N端带有6-His标签的重组蛋白。部分N端标签可能因空间位阻、折叠方式或邻近氨基酸序列的影响而无法被有效识别。建议用户在使用前通过已知阳性对照（如C端或内部标签蛋白）确认抗体工作状态，或在实验中同时设置标签位置已知的对照样本。

特异性与交叉反应性

本抗体由KLH偶联的线性6-His多肽诱导产生，经亲和纯化后对六个连续组氨酸残基具有高度特异性。无标签蛋白或仅含单个/两个组氨酸的蛋白通常不会产生交叉反应信号。

识别偏好：

C端6-His标签：通常识别良好

内部6-His标签：识别效果取决于具体序列背景

N端6-His标签：部分蛋白可识别，部分不可识别（需实测验证）

潜在交叉反应：天然蛋白中罕见的富含组氨酸区域可能产生弱交叉反应，但发生率较低。建议在实验中设置未转染或空载体对照以评估背景。

产品设计原理与生物学背景

6-His标签是重组蛋白技术中最广泛使用的亲和标签之一。其作用原理基于组氨酸残基的咪唑侧链与固定化金属离子（如Ni??、Co??）之间的配位相互作用，从而通过金属亲和层析（IMAC）实现高效纯化。典型的纯化条件使用低浓度咪唑（20-50 mM）去除杂蛋白，高浓度咪唑（250-500 mM）洗脱目标蛋白。

本抗体作为检测工具，可用于：

验证重组蛋白的表达和纯化效果

监测蛋白纯化过程中的流穿、洗脱组分

免疫沉淀富集His标签融合蛋白

细胞内定位研究（ICC）

由于6-His标签分子量小（约0.8 kDa），通常不影响融合蛋白的结构和功能，无需在纯化后切除标签，因此成为蛋白研究的首选标签之一。

应用与推荐稀释比例

以下推荐稀释比例为起始参考值。需注意，并非所有列出的应用均已在本实验室完成具体验证。建议用户在首次使用时根据样本类型和实验体系进行梯度优化。

应用 推荐稀释比例或用量 备注

酶联免疫吸附测定 1:1000 - 1:30,000 包被酶标板时推荐1:100 - 1:500

免疫细胞化学 1:100 - 1:400

免疫沉淀 1 - 4 ?g/mg 裂解物 即每毫克总蛋白使用1-4微克抗体

免疫印迹 1:1000 - 1:30,000

免疫印迹（WB）标准操作条件（经实验室验证）：

封闭液和抗体稀释液：5% 脱脂牛奶-TBST

一抗孵育：过夜（4°C或室温）

细胞裂解液WB的二抗：推荐使用山羊抗兔IgG（H+L）抗体（货号A120-101P）

免疫沉淀样本WB的二抗：推荐使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清（货号S100-020），以避免重链交叉信号干扰（该二抗仅识别兔IgG轻链，不与免疫沉淀中变性的兔IgG重链发生反应）

典型应用场景：

ELISA：检测含有6-His标签的分泌型或纯化重组蛋白，常用于定量分析。

免疫印迹：确认重组蛋白的表达水平、分子量及降解情况。

免疫沉淀：从细胞裂解物中富集6-His标签融合蛋白，用于后续酶活检测或质谱分析。

ICC：定位表达6-His标签融合蛋白的细胞，评估转染效率和亚细胞分布。

使用与保存注意事项

保存条件：请于2-8°C条件下保存，切勿冷冻。反复冻融会导致抗体变性失效。在指定条件下，自收货之日起1年内稳定有效。

防腐剂提示：缓冲液含0.09%叠氮钠作为抗菌防腐剂。如后续实验涉及细胞培养或对叠氮钠敏感的HRP偶联反应，请通过透析或脱盐柱去除。

稀释缓冲液建议：除WB使用5%牛奶-TBST外，其他应用推荐使用含1% BSA的正常血清稀释液。避免使用含高浓度咪唑的缓冲液稀释抗体，因为咪唑可能干扰抗原-抗体结合。

阳性对照建议：

已知表达的6-His标签重组蛋白（建议C端标签对照）

商业化的His标签阳性对照裂解物

阴性对照建议：

未转染或无标签的细胞裂解物

使用正常兔IgG替代一抗

N端标签检测问题排查：

若目标蛋白为N端6-His标签且检测信号弱或无信号，可尝试以下优化：

使用变性条件（如煮沸）充分暴露表位

尝试更高浓度的抗体（如1:500）

考虑更换识别N端His标签的专用抗体

通过点印迹或ELISA确认抗体活性