Zedira：微生物转谷氨酰胺酶

近年来，许多技术被开发用于将功能性分子以非特异性或位点特异性的方式连接到蛋白质上。特别是在治疗性抗体药物偶联物（ADCs）领域，毒性化合物的位点特异性偶联是一个热门话题。

通过位点特异性偶联，蛋白质与连接分子的比例可以被精确控制，从而获得化学计量明确的偶联物。例如，这避免了偶联到蛋白质的关键相互作用位点，从而维持了蛋白质的亲和力。对于ADCs而言，与非均一修饰的ADCs相比，这能提高肿瘤摄取量。? 作为位点特异性技术，酶促偶联引起了极大关注，因为这些偶联反应通常快速且可在生理条件下进行。在现有的酶中，来自链霉菌（Streptomyces mobaraensis）基因，在大肠杆菌中重组产生的微生物转谷氨酰胺酶（MTG）最近被认为是将化学实体（包括抗体）偶联到蛋白质上的一种有趣的替代传统化学偶联的方法。MTG在生理条件下催化蛋白质上一个"反应性"谷氨酰胺与一个"反应性"赖氨酸残基之间的转酰胺反应，其中后者也可以是一个简单的低分子量伯胺，如5-氨基戊基。² 对于蛋白质上的内源性谷氨酰胺要被识别为MTG底物，两个标准似乎很重要：

1）谷氨酰胺周围的疏水性氨基酸似乎促进偶联；

³2）谷氨酰胺必须位于具有局部链柔性的环上，以增强对MTG的反应活性。

然而，根据厂家实验室以及其他研究员的经验，似乎只有少数谷氨酰胺通常满足这些要求，⁵例如在抗体中，这使得MTG成为一种有吸引力的位点特异性和化学计量蛋白质修饰工具。

MTG mechanism¹⁰

Schibli课题组鉴定了不同IgG重链上可被MTG识别的单个反应性谷氨酰胺：Q295。该残基位于一个环上，当对天冬酰胺297（N297）进行酶法去糖基化后，该环变得柔性，能够与各种底物轻松且高效地偶联。? 这一特性使得抗体可以直接以简单的方式进行修饰。通过这种方法，恰好可以将两个化学实体偶联到抗体骨架上。进一步发现，通过将天冬酰胺297经基因突变替换为谷氨酰胺（N297Q），还可以再连接两个底物，从而生成一个共价且均一地连接有四个底物的抗体。例如，掺入四个高毒性药物对于制备抗体药物偶联物（ADCs）尤其具有吸引力，因为药物载量对有效杀伤肿瘤起着决定性作用。

Antibody conjugation using Q295 and mutation N297Q¹⁰

在我们的研究中，我们还观察到，仅由10个氨基酸组成且含有一个谷氨酰胺的基因工程引入的myc标签，能够被MTG高效识别。通过序列分析，我们确定该反应确实是由myc标签内的谷氨酰胺所催化的。? 由于myc标签常被用作重组蛋白表达后的蛋白质鉴定工具，因此MTG介导的生物偶联可以简便地用于生成均一的偶联物，将一个功能性基团（如生物素-尸胺、荧光染料或放射性螯合剂）连接在末端的myc标签上。例如，这种生物素化可用于将蛋白质固定在固体表面，从而提供可控的取向。对于固定化的抗体片段等而言，可控取向可能增强其与抗原的相互作用，相比之下，随机取向由于部分相互作用位点因不利取向而不可接近，效果较差。这也适用于分子与蛋白质的非受控偶联，因为这些分子同样可能连接到重要的蛋白质相互作用位点，导致结合力下降、对其靶标结合亲和力降低。相反，末端连接可能会维持高亲和力结合，因为可以避免此类有害效应。此外，以非受控方式连接多个基团通常会改变偶联蛋白质的溶解性行为，特别是当所连接的基团体积大且疏水时。溶解性改变可能导致不利的蛋白质偶联物聚集，并最终沉淀，造成宝贵材料的损失。而使用MTG，可以控制疏水分子的连接数量，生成溶解性良好的偶联物。

像myc标签这样的基因标签不仅可以置于蛋白质的末端，还可以直接嵌入蛋白质的骨架中。

Conjugation to proteins using myc-tag¹⁰

例如，辉瑞（Pfizer）公司已在抗体上实现了这一点，他们通过基因工程改造抗体的氨基酸序列，使其在不同位置能够利用MTG和一个短的四氨基酸基序掺入探针。⁸ 这种方法实际上允许在任何位置偶联任何探针，只要该位置足够可及，且引入序列后蛋白质结构不会受到损害。因此，该方法需要仔细的结构分析，以评估和确定干扰最小的位点。

Engineered backbone conjugation¹⁰

当酶对某种底物不耐受导致偶联产率较低时，MTG也可用于蛋白质的化学酶促功能化。具体做法是：首先将一个小的"双功能"间隔臂偶联到蛋白质上，该间隔臂包含一个伯胺（可被MTG识别）和一个适合后续生物正交偶联功能分子的反应基团。在第二步纯化后，功能分子可以低分子过量轻松地偶联到已修饰的蛋白质上。利用这种方法，我们能够高效地将大分子毒素以低分子过量偶联到抗体上，并获得明确的化学计量比。?

Chemo-enzymatic modification¹⁰

综上所述，MTG介导的生物偶联是一种非常具有吸引力的工具，可用于高效生成均一修饰的蛋白质，几乎适用于所有含伯胺的底物。然而，由于MTG对谷氨酰胺和赖氨酸残基具有一定的广谱性，且没有明确的底物偏好，因此开发具有改变底物特异性的MTG将是非常可取的，以便能够偶联不同的分子——这将是未来研究的任务。

参考文献：

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10. Figures with courtesy of Philipp Spycher, 2015

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