神奇的荧光素酶（一），知否知否

        荧光素酶（luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

        目前，最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（Firefly  luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（Renilla  luciferase）。其中萤火虫荧光素酶作为报告基因反应目的基因表达的改变，肾荧光素酶作为内参基因，为实验提供统一基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数目，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。

实验原理

        萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波长540-600nm。

        肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460-540nm，一般检测时选用460nm

        利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

应用类型

        由于两种酶底物和发光颜色的区别，且在动物体内无内源性表达，使其双报告基因系统在基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域得到广泛应用。

        启动子研究：转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

        miRNA研究：主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体报告基因萤火虫荧光素酶的3’端，通过比较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

        荧光素酶检测试剂盒(萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶由于都是非分泌型蛋白，所以在检测之前需要对过表达细胞进行裂解处理)：

        荧光素酶报告基因载体：

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