Worthington 常见问题大解析

Worthington来与您分享常见问题啦！看看有没有你挠头的小问题~

一、组织解离（Tissue Dissociation）

Q1：胶原酶（CLS）溶解稀释液是什么？

胶原酶可直接溶解于平衡盐溶液或所选缓冲液中。应通过0.22μm孔径膜无菌过滤。其最适pH范围为7-9。

Q2：新生心肌细胞分离系统（NCIS Kit）能否用于成年动物？

NCIS试剂盒专为五次独立组织解离包装，每次最多可用12个新生大鼠心脏。成年大鼠心肌细胞通常需要灌流，即使用Langendorf灌流系统和胶原酶II型。

Q3：Hank's、Earle's和Leibovitz L-15培养基的规格是什么？

无菌无钙镁Hank's平衡盐溶液，pH 7.4，随NCIS试剂盒提供。可单独购买500ml瓶装，目录号LK003210。

Leibovitz L-15培养基粉末，随NCIS试剂盒提供。将整袋粉末重悬于800ml细胞培养级水中，用额外100ml水冲洗袋子2-3次，定容至1升，经0.22μm孔径滤膜过滤。1升装粉末目录号LK003250。

无菌Earle's平衡盐溶液（EBSS），含钙、镁、碳酸氢盐和酚红，随PDS（木瓜蛋白酶解离系统）试剂盒提供。可单独购买100ml瓶装，目录号LK003182。

Q4：中性蛋白酶/分散酶（NPRO/NPRO2）溶解稀释液是什么？

中性蛋白酶通常溶解于所选中性平衡盐溶液（如PBS、Hanks、Earles等）。多种平衡盐溶液的组成可在我们的组织解离指南中查看。 中性蛋白酶常用工作液为0.5-3.0 u/ml，但此范围差异很大，取决于应用、稀释液、孵育时间和温度。一般建议按需稀释酶，因为冻干粉在2-8°C稳定。重悬后的酶不应在2-8°C储存。如有必要，可分装后于-20°C冷冻。避免反复冻融。

Q5：脱氧核糖核酸酶（D/DPFF/DPRF）溶解稀释液是什么？

D/DPFF：可溶解于5mM乙酸、1mM钙、pH 4.5的溶液中，分装后于-20或-70°C储存1年。

DPRF：使用水或任何pH 4-9的缓冲液，避免磷酸盐，避免钙螯合剂，添加50%甘油后可在-20°C以液体形式储存。分装，避免反复冻融。

脱氧核糖核酸酶需特别小心处理。轻柔混合以避免剪切变性。通常，Dnase I被二价金属激活，Mg??和Ca??可获得最大激活。Dnase I被EDTA和SDS抑制。牛胰腺脱氧核糖核酸酶I的最适pH为7.8。

Q6：弹性蛋白酶（ES）溶解稀释液是什么？

缓冲液、浓度和pH的选择通常取决于应用。弹性蛋白酶相对疏水，因此在中性pH下浓度大于0.25%时溶解性具有挑战性。 弹性蛋白酶在pH 4-10.4范围内稳定，最适pH接近8.5。对于细胞培养应用，当中性平衡盐溶液中需要更高浓度（>2.5%）时，将pH提高至9-10有助于溶解，然后可将pH降至中性以保持细胞活力。 大多数实验室直接溶解于所选平衡盐溶液中。最好现用现配，但如果必须储存储备液，可分装后于-20°C或-80°C冷冻。需自行确定冷冻稳定性。使用前应通过0.22μm孔径膜无菌过滤。

Q7：木瓜蛋白酶（PAP/PAPL）溶解稀释液是什么？

木瓜蛋白酶常用工作液为20 u/ml木瓜蛋白酶，溶于含1mM L-半胱氨酸和0.5mM EDTA的平衡盐溶液（如EBSS等）中。EDTA、半胱氨酸和二巯基乙醇被视为稳定剂。最适pH范围为6.0-7.0。

Q8：胰蛋白酶（TRL）溶解稀释液是什么？

胰蛋白酶储备液应首先用0.001N HCL重悬。该溶液可在消化培养基或缓冲液中稀释后即刻使用。胰蛋白酶的最适pH约为8.0。

Q9：胶原酶（CLS）的单位换算因子是什么？

Wunsch单位和Mandl单位之间没有一致的换算单位。 Worthington测定法基于改良的Mandl单位，约0.15 Wunsch单位等于200 Mandl单位。

Q10：脱氧核糖核酸酶（D/DP/DPRFF）的单位换算因子是什么？

注意：其他供应商报告的Kunitz单位可能比Worthington测定的Kunitz单位高2-4倍。在Worthington的测定中，一个Kunitz单位在50mM Tris、1mM Mg²⁺、1mM Ca²⁺、pH 7.8条件下，于37°C 10分钟内消化1μg小牛胸腺DNA。消化单位与Kunitz单位的相关性因其他DNA和缓冲系统而异。当存在蛋白酶时，单位无法关联。

Q11：胰蛋白酶（TRL）的单位换算因子是什么？

1 mg Worthington TRL > 180 TAME units > 10,350 BAEE units> 3,450 USP/NF units

Q12：酶消化能力标度是什么？

（组织解离酶的相对消化能力标度）

Q13：四种胶原酶之间的基本区别是什么？

Q14：每种胶原酶的测试规格是什么？

Q15：胶原酶I型是否含有脑心浸液（BHI）？

脑心浸液（BHI）发酵培养基未用于Worthington CLS-1或任何Worthington胶原酶产品的生产。

Q16：哪种培养基与胶原酶I型配合最佳？有同学使用DMEM，但总是使用含2% FBS或0.5% BSA的PBS。对于小鼠骨髓分离，建议？

胶原酶在大多数平衡盐溶液（如Hanks、Earles、PBS、DMEM）中效果良好。选择通常更具应用或组织特异性。我们此处未进行小鼠骨髓实验，因此不愿选择某一种。建议通常基于参考文献。您可在www.tissuedissociation.com搜索我们的组织解离指南，按组织类型查找参考文献。

Q17：新生心肌细胞分离系统的有效期是多久？

NCIS试剂盒自首次发布/测定之日起给予一年有效期。购买前您可随时请求重新测定日期信息。

Q18：使用Dispase II约2.5 mg/ml，37°C 2小时或4°C过夜，用于皮肤活检中表皮与真皮的解离。对于此操作，推荐的中性蛋白酶浓度是多少？

Dispase II通常指分散酶的部分纯化级别，类似于Worthington的NPRO2。历史上大多数NPRO2批次平均约0.4 u/mg，因此1 u/ml我们的中性蛋白酶应类似于2.5 mg Dispase II。中性蛋白酶工作浓度通常在0.5-2.0 u/ml范围内。

Q19：新生心肌细胞分离系统能否用于小鼠？

新生儿心肌细胞分离系统已专门包装，并在新生大鼠上进行了使用测试。

少数研究人员已对新生小鼠进行了该系统的应用，并作了一些修改。文献推荐：新生小鼠的心脏可能需要比大鼠更高的酶浓度和/或更长的消化时间。将胶原酶的消化时间延长至45分钟是优化的一个良好起点。此外，有研究人员通过将最终体积减半，将胰蛋白酶的浓度提高到了100ug/ul。

http://ajpcell.physiology.org/cgi/content/full/277/6/C1277#SEC1

http://www.jbc.org/cgi/content/full/277/50/48282

http://www.pnas.org/cgi/content/full/95/16/9669#MaterialsMethods

Q20：如何将透明质酸酶的单位/mg dw干重转换为U/ml？

Worthington以冻干粉形式供应透明质酸酶，在COA报告u/mg干重。可使用此信息将透明质酸酶重悬至所需的u/ml。 例如，当前批次的透明质酸酶为525 u/mg dw，如果需要500 u/ml溶液，您将用5.25 ml稀释5 mg以获得500 u/ml。计算：5mg × 525u/mg =2625 units/5.25 ml=500 u/ml

Q21：Worthington提供的不同类型胶原酶与其他供应商的胶原酶？

Q22：胶原酶产品是否检测内毒素？

Worthington已对胶原酶进行内毒素检测。使用鲎变形细胞裂解物（LAL）测试对样品中的内毒素水平进行定量。结果在COA上报告。

Q23：胶原酶IV（100mg）要求2mg/ml浓度，其他方案要求0.2%溶液。如何制备0.2%溶液？

0.2%溶液相当于2 mg/ml。请记住，1%溶液指1g/100ml或10 mg/ml。

Q24：纯化胶原酶CLSPA中含有哪种类型的胶原酶？

CLSPA是来自溶组织梭菌的细菌胶原酶，经柱层析进一步纯化并根据活性进行合并。CLSPA具有更高的胶原酶活性（>500 u/mg DW，通常约1000 u/mg），且酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶样活性显著低于粗制CLS 1-4型。我们不表征每批次的具体组成，但它是多种胶原酶的混合物，含有胶原酶A和B（有时称为I和II）。胶原酶活性（包括CLSPA）的每日列表发布于此处。

Q25：透明质酸酶，目录号LS005474。活性显示≥3000 USP/NF单位/mg干重。能否将其转换为mg？

透明质酸酶按单位销售。提供的mg可能因每批次的u/mg活性而略有不同。比如：HSEP LS005474的当前批次为58E10498，发布为7,654 u/mg干重。对于此批次，30,000 unit包装将含约4 mg（30,000 unit/7,654 u/mg = 4mg）。

Q26：关于"新生心肌细胞分离系统"方案，您提供的L-15培养基中是否已添加血清，还是需要我单独添加？如果已有血清，是否可以在无血清条件下培养细胞？

L-15培养基中不含血清。目前不继续在此培养细胞，仅通过 trypan blue检查初始产率和细胞活力。如果您打算长期培养细胞，添加血清会更有利。遗憾的是，无法将细胞培养到初始活力和细胞计数之外。关于培养基和添加剂的选择，建议咨询培养基专家（如JRL或Gibco），或查阅相关参考文献。以下列出的部分参考资料可能对您选择培养基和添加剂有所帮助。

http://www.nature.com/cdd/journal/v8/n4/full/4400810a.html

http://www.biomedcentral.com/1471-2121/5/15

http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/100/23/2373#SEC1

二、蛋白质测序（Protein Sequencing）

Q27：使用Protease S. aureus V8 (Endoproteinase-Glu-C) 进行蛋白水解消化的推荐条件是什么？

Protease S. aureus V8 (Endoproteinase-Glu-C) 特异性切割天冬氨酸或谷氨酸羧基端的肽键。在铵离子存在下，酶特异性优先针对谷氨酸位点。其分子量为27,000道尔顿，以血红蛋白为底物时的最适pH为4.0和7.8。

Protease S. aureus V8 (Endoproteinase-Glu-C) 被二异丙基氟磷酸和单价阴离子（如F?、Cl?、CH?COO?和NO??）抑制。 通常STAP以低酶/蛋白比范围1:10至1:50使用，在铵缓冲液（pH范围4-8）中于37°C孵育数小时（2-48小时）。

三、产品支持（Product Support）

Q28：纯化胶原酶（产品代码CLSPA）是否可作为CLS取样程序的一部分？

不，采样计划旨在消除粗制胶原酶的批次间差异。对于CLSPA，由于大部分其他蛋白酶已通过柱纯化显著去除或降低，因此批次间实际上没有差异。如果研究人员想尝试CLSPA，他/她需要购买4KU小瓶（约4 mg）。 粗制胶原酶仍被广泛使用，因为粗制胶原酶中的"其他"蛋白酶有助于消化。结缔组织不仅由胶原维持，因此当使用纯化胶原酶时，通常与另一种蛋白酶（enzyme cocktail）联合使用。

http://www.tissuedissociation.com/theory.html

http://www.tissuedissociation.com/techniques.html

Q29：梭菌蛋白酶使用的指南有哪些？

梭菌蛋白酶在精氨酸残基羧基端切割肽，钙离子对最大活性是必需的。还原剂如DTT、半胱氨酸或巯基乙醇被视为激活剂，因为它们保护酶免受氧化失活。该酶被氧化剂、巯基反应剂和重金属离子抑制。柠檬酸、硼酸和Tris阴离子抑制性较低。 使用的最佳条件需经验确定，但以下回答一般性问题：

应使用什么蛋白质浓度？

典型酶与样品蛋白比例范围为1/20至1/100。

需要多长时间？

孵育时间取决于待消化蛋白质的性质和温度——典型范围：37°C下1至数小时。

使用什么缓冲液？

含1mM钙和2.5mM DTT（或巯基乙醇）的所选缓冲液，pH范围7.4-7.8。 可最初以1 mg/ml用水重悬梭菌蛋白酶，分装后冷冻（避免反复冻融）。 以下参考文献/链接使用梭菌蛋白酶进行蛋白质切割

http://www.jbc.org/cgi/content/full/272/42/26530#SEC1

http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/34/31796#SEC1

Q30：重组HIV逆转录酶（HIVRT）来自哪种HIV毒株？

Worthington的HIVRT克隆自命名为pHX2D的HIV亚克隆。这是HIV 1型毒株HXB2的亚克隆——GenBank登录号K03455（M38432）。HXB2的序列描述于Rather et al, 1985, Nature 313:277-284。

来源为大肠杆菌质粒pRC-RT。 HIV pHX2D逆转录酶的克隆描述于以下论文：

Becerra, S.P, Kumar, A and Wilson, SH, Protein Expression and Purification 4:187-199, 1993.

Becerra et al, Biochemistry 30:11707-11719, 1991. 我们的重组克隆表达p66/p51异二聚体，代表天然野生型蛋白（登录号V53871）。

Q31：卵清蛋白（Ovalbumin）中含有多少内毒素？

内毒素检测不是卵清蛋白代码OA（LS003049）或OAC（LS003054）的放行标准，因此大多数批次未检测。如果您需要低内毒素卵清蛋白，需要代码OAEF（LS003059, 3061, 3062），其内毒素值小于1 EU/mg。

Q32：磷酸二酯酶I粉末。每次实验需要称量非常少量的粉末，倾向于将其溶解在缓冲液中保存。这样做可以吗？如果可以，使用什么缓冲液？

质控部门用2ml 0.11M Tris pH 8.9（含0.11M NaCl和15 mM MgCl）重悬100单位小瓶的磷酸二酯酶I（代码VPH），分装（避免反复冻融）后于-20°C冷冻。在这些条件下，冷冻分装液可稳定保存数月。

Q33：脱氧核糖核酸酶I（DCLS）。如何制备储备液？可以用蒸馏水溶解粉末吗？

取决于应用，DNase I可溶解于水或多种缓冲液中。重悬后应分装并于-20°C或-80°C冷冻。避免反复冻融。长期储存时，我们将Dnase I溶解于含1mM钙的5mM乙酸缓冲液pH 4.5中。最好将储备液冷冻在约1mg/ml，因为非常稀释的溶液稳定性较差。

Q34：核糖核酸酶A（RAF，过滤级）在-20°C储存后是否仍然稳定（产品说明要求2-8°C）？

核糖核酸酶A可在-20°C冷冻储存。将冻干核糖核酸酶A（代码RAF）储存在2-8°C，至少稳定两年。将核糖核酸酶A储存在-20°C不会损害酶。

酶是Worthington的主要产品线。从技术上讲，Worthington实际上并不制造酶，而是从各种动植物组织和各种微生物来源（如细菌、真菌和霉菌）中提取酶。根据该酶在材料中的普遍性选择特定酶的起始材料。例如，一种功能涉及使肌肉工作的酶将主要存在于肌肉组织中，因此起始材料可能是兔肌肉或猪心；参与发酵的酶最好在酵母中找到。 Worthington使用的一些动物组织包括牛胰腺、猪肾、牛眼、马肝、兔肌肉、牛肝、猪心、马血和小牛肠。各种蛋白质也从辣根、红薯、杏仁和美洲商陆中提取。一些产品是从大肠杆菌、几种梭状芽胞杆菌和各种其它细菌中分离出来的。还使用酵母、蘑菇、全脂牛奶和鸡蛋等。

Worthington Biochemical Corporation——当您的研究需要最可靠的酶，Worthington不仅是供应商，更是78年来科学家信赖的酶学伙伴。

作为Worthington在中国的区域代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的Worthington以及客户订制化服务。欢迎大家随时联系我们。