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钙离子荧光探针常见问题大盘点

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-06-02     
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钙可作为多种细胞中的通用第二信使,Ca 2+调节所有类型细胞的许多功能,因此钙测量对于各种生物学研究至关重要。在1980年代,Tsien及其同事生产了各种荧光指示剂。其中Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Rhod-2是测量Ca 2+浓度的最有价值的染料。近年来,荧光探针领域引领者AAT陆续推出了更优秀的钙离子探针:Fluo-8 ?,Cal-520 ? 和Calbryte?520,这些为实现高通量监测钙浓度,筛选GPCR和钙离子通道药物筛选提供了有力的工具。

 

然而,面对市面上五花八门的钙离子探针,我们该如何选择呢,别慌,小艾之前撰写的这两篇文章可以带给大家一些帮助:

钙离子荧光探针大盘点—助您拍出好钙片,点击了解

钙离子荧光探针专题2——比值型荧光探针,点击了解

 

本期我们总结了几个关于钙离子探针的常见问题,都是平时大家经常咨询的,相信大家或多或少也遇到过相关的问题,今天做了一个汇总希望能给大家带来一些帮助:

 

1.检测内质网(ER)线粒体内的钙离子浓度变化,该使用哪款探针

线粒体钙离子检测:Rhod-2(21060),Rhod-2,是罗丹明123(Rhodamine 123)的衍生产物,一种与钙离子结合产生荧光,同时由于其正电荷特性,会特异性聚集在线粒体里,由此用于测定线粒体内钙离子水平。在荧光酶标仪下,激发波长550nm,发射波长 590nm,可用来定量测定线粒体中的钙浓度。

内质网钙离子检测: Cal-520N(Cat# 21146), Calbryte 520L(Cat# 20640), Fluo-5N(Cat# 20566)和Mag-fluo4(Cat# 20401);

 

关于内质网内钙离子标记可参考下方文献:https://www.researchgate.net/profile/Alexei-Verkhratsky/publication/226512100_

Ca2_Imaging_of_Intracellular_Organelles_Endoplasmic_Reticulum/links/0c96052961398ab829000000/Ca2-Imaging-of

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2.检测细胞中钙离子时加入丙磺舒(probenecid)的作用是什么?文献报导丙磺舒(probenecid)可能干扰钙离子通道,比如干扰环核苷酸门控通道,有没有可以不用丙磺舒的钙离子探针?

丙磺舒(probenecid),是一种阳离子转运体抑制剂,用来降低探针进入胞内后被排除的几率,以提高胞内信号。常见的Fluo-3 、fluo-4、 Fluo-8都需要加丙磺舒,否则信号会很低。您可以选择Calbryte系列,该系列无需丙磺舒(probenecid)仍会有很好的信号。

 

存在丙磺舒.jpg

不存在丙磺舒.jpg

图示:存在丙磺舒(左)和不存在(右)的情况下进行Ca2+检测测定,并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3测量了截止波长为570 nm的响应。

 

加或者不加丙磺舒(probenecid)对Fluo-4和Calbryte 520荧光标记结果的影响.jpg

图示:加或者不加丙磺舒(probenecid)对Fluo-4和Calbryte 520荧光标记结果的影响

 

3.荧光探针的AM、盐形式、Dextran葡聚糖形式有什么区别?

AM酯形式:AM酯形式是一种可以透过细胞膜进入细胞的,不需要其他辅助工具;

盐形式:盐形式的Fluo-8不能自行穿过细胞膜,需要辅助进入细胞,如微量注射等;

Dextran葡聚糖形式:若检测孵育时间久容易发生区室化,比如钻进了内质网等亚器官内,Dextran最大的优势就是降低了区室化作用,但是需要显微注射或其他方式才能进入细胞内。

 

4.有定量检测样本中钙离子的试剂盒吗?

人体血液里钙离子的浓度大约在19 -10.5 mg/dL范围内,血液里钙离子浓度过低或者过高可引起低钙血症和高钙血症。Amplite 荧光法钙离子定量试剂盒(Cat#36360)可用于定量体液的钙离子浓度,可使用96孔或者384孔板经酶标仪读取数值, 不需进行样本分离直接检测,30min可完成,最低检测到0.03mM的钙离子。

 

5.有能用于植物细胞拟南芥原生质体的钙离子探针吗?

常用的 Fluo-4 AM, Fluo-8 AM 以及 Calbryte 520 AM, 都适用于植物细胞,Fluo-4最常用,若要获得更好的信噪比,推荐其升级版本 Calbryte 520 AM。

 

参考文献:

https://www.nature.com/articles/s41438-020-0315-3

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975371/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2923527/

 

6.常见的几款绿色的钙离子探针各有哪些优缺点?

 

几款常见绿色钙离子荧光探针性能比较:

产品名称Ex/Em(nm)(信号背景比)S/B相对亮度细胞内
保留
加载时间其他
Fluo-3506/526250相比最低1 h在相同条件下,Calbryte探针的亮度明显更高
Fluo-4494/5164.51001 h
Fluo-8490/5144.5~2000.5-1 h
Cal-520492/5149.0~1501-2 h
Calbryte-520490/51410.0~3500.5-1 h

 

几款绿色荧光探针的荧光亮度对比:


几款绿色荧光探针的荧光亮度对比:.jpg

 

7.单波长探针与比值型探针的区别有哪些?

 

绿色
荧光探针
红色
荧光探针
深红色
荧光探针
比率荧光探针(确定绝对和相对Ca2+浓度)钙离子
免洗产品
Fluo-3
Fluo-4
Fluo-8
Cal-520
Calbryte 520
Rhod-2
Rhod-4
Cal-590
Calbryte 590
Cal-630
Calbryte 630
Fura-2
Fura-8
Fura-10 (NEW)
Indo-1
Cal Red R525/650
Fluo-4(免洗): 36325
Fluo-8(免洗): 36315
Calbryte 520(免洗、免丙磺舒):36318
Fura-2(免洗):36320
Rhod-4(免洗): 36334
Calbryte 590(免洗、免丙磺舒): 36201

 

单波长与比率法的优缺点对比

单波长比值型
1.在静息钙水平下背景荧光最小
2.良好的信噪比
3.大大提高了细胞内保留
4.覆盖光谱:紫外线(UV),紫色和可见光激发
5.不同的亲和力(低、中、高)提供的敏感度满足于各种应用
1.准确测量细胞内钙浓度
2.将染料负载不均匀、染料泄漏、光漂白和细胞厚度变化(常见于混合群体)的影响降至最低
3.提供更可靠和可重复的结果
4.指示剂拥有双激发/发射光线

 

常见钙离子探针推荐:

颜色名称货号
绿色荧光Fluo-321010
Fluo-420550
Fluo-821080
Cal-52021130
Calbryte 520(不需要丙磺舒)20650
 红色荧光Rhod-221060
Rhod-421120
Cal-59020510
Calbryte 590(不需要丙磺舒)20700
深红色荧光Cal-63020530
Calbryte 630(不需要丙磺舒)20720

 

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