UbiTest缓冲液：高特异性泛素化检测的关键

泛素蛋白酶体系统（UPS）是一种高度调控的机制，通过蛋白质的泛素化和降解来控制许多细胞过程。泛素通过其C末端与目标蛋白上的赖氨酸残基结合，可以以单体形式或聚合链形式存在。泛素链可以通过泛素的第一个甲硫氨酸（M1）形成线性链，也可以通过其七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）形成特定赖氨酸链。K48和K63连接的泛素链是细胞中最为主要的多泛素化形式。

泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶（DUBs）可以去除目标蛋白上的泛素，从而拯救它们免于蛋白酶体降解。确定目标蛋白上的多泛素化程度和类型对于理解它们在正常细胞过程以及与UPS相关疾病状态中的泛素介导调控至关重要。传统上，这些过程是通过质谱分析或使用抗泛素抗体进行免疫沉淀后，再进行免疫印迹来监测的。然而，在免疫印迹步骤中，由于表位掩盖、亲和力降低或蛋白质多泛素化导致的选择性变化，底物抗体常常与底物的多泛素化形式产生不同的相互作用。

图1：UbiTest检测的示意图：通过磁性TUBEs捕获富集泛素化蛋白，然后从TUBEs中洗脱。分离的多泛素化洗脱液被分成两部分：一部分保持未处理状态，而第二部分用广谱去泛素化酶（DUB）消化以去除泛素链。两部分均使用针对目标蛋白（POI）的抗体进行免疫印迹分析。从多泛素化POI上去除泛素链后，在免疫印迹中可以看到一个单一的、未修饰的POI条带。

一种更明确的证明蛋白质泛素化的方法是，在免疫印迹分析之前，将免疫沉淀与使用广谱去泛素化酶（DUB）进行去泛素化相结合。如果在经过DUB处理后，目标蛋白（POI）的信号增强，这表明该蛋白即使在未处理的样本中没有明显的反应性，也已经发生了泛素化。

LifeSensors的UbiTest检测利用TUBEs（串联泛素结合实体）来捕获多泛素化蛋白，以避免由于POI免疫反应性变化而可能出现的问题。TUBEs是经过工程改造的串联泛素结合结构域，其与多泛素的解离常数在纳摩尔范围内。LifeSensors的泛选择性TUBEs已被证明能够结合所有八种泛素连接类型。

为了确定目标蛋白上多泛素化的连接类型，LifeSensors开发了一种更具针对性的方法，该方法在免疫印迹分析之前使用特定连接类型的DUB。如果在经过K48/K63特异性DUB处理后，与未修饰POI对应的条带信号增强，则表明该蛋白发生了K48/K63多泛素化。

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